1. Obat a. Sifat fisikokimia obat
b. Konsentrasi total obat dalam tubuh 2. Protein
a. Jumlah protein yang tersedia untuk ikatan obat protein b. Kualitas atau sifat fisikokimia protein yang disintesis
3. Afinitas antara obat dan protein meliputi besarnya tetapan asosiasi 4. Interaksi obat
a. Kompetisi obat dengan zat lain pada tempat ikatan protein b. Perubahan protein oleh substansi yang memodifikasi afinitas obat
terhadap protein, sebagai contoh aspirin mengasetilasi residu lisin dari albumin.
5. Kondisi patofisiologik dari penderita, sebagai contoh ikatan obat protein dapat menurun pada penderita uremia dan penderita dengan penyakit
hepatik. Shargel Andrew, 1985
D. Analisis Obat dalam Plasma
Plasma merupakan komponen cair dari darah dimana sel-sel darah tersuspensi. Plasma adalah suatu cairan kompleks berwarna kuning pucat yang
berfungsi sebagai medium transportasi untuk zat-zat yang diangkut dalam darah. Plasma mengandung 90 air, 8 protein, 0,9 ion inorganik, dan
1,1 molekul organik. Semua konstituen plasma dapat berdifusi bebas menembus dinding kapiler kecuali protein plasma, yang tetap berada di dalam
plasma dan melakukan berbagai fungsi. Volume total plasma pada orang dewasa normal sekitar 2,5 - 3 liter atau mencapai 55 - 58 volume darah.
Plasma mengandung suatu senyawa pembeku dan akan membeku bila terpapar oleh udara. Namun untuk mencegah pembekuan plasma dapat ditambahkan
suatu antikoagulan seperti sitrat atau heparin Sherwood, 1996. Untuk kepentingan analisis obat, sampel plasma merupakan sampel
yang paling umum digunakan karena ada hubungan yang baik antara konsentrasi obat dalam plasma dengan efek terapetik yang ditimbulkan Kelly,
1990. Dalam beberapa kasus, konsentrasi obat dalam plasma yang diukur mencapai level mikrogram sampai nanogram atau pikogram. Untuk itu, dapat
digunakan metode KCKT karena salah satu keuntungan dari KCKT adalah dapat menghitung sampel dengan kadar yang sangat rendah Johnson, 1991.
Namun matriks biologis seperti halnya plasma mengandung sejumlah besar komponen endogen yang dapat mengganggu analisis. Oleh karena itu, sampel
plasma perlu diberi perlakuan sebelum diinjeksikan pre treatment untuk memisahkan analit yang akan dianalisis dari komponen endogen plasma yang
dapat mengganggu analisis. Hal tersebut dapat dilakukan dengan beberapa cara diantaranya dengan pengendapan protein plasma, ultrafiltrasi, ekstraksi
cair-cair, ekstraksi fase padat SPE, dan supercritical fluid extraction SFE Kelly, 1990; Schulman, 2002.
Konsentrasi obat dalam plasma umumnya rendah pada dosis terapi, oleh karena itu diperlukan persiapan sampel khusus untuk analisis obat dalam
plasma. Dalam plasma, obat terikat pada permukaan protein sehingga harus dibebaskan terlebih dahulu, medroksiprogesteron asetat dalam plasma
berikatan dengan protein plasma sebesar ± 90, sehingga diperlukan perlakuan tertentu untuk membebaskannya sebelum dianalisis.
Beberapa metode analisis medroksiprogesteron asetat dalam plasma yang telah dilakukan oleh beberapa peneliti terdahulu yaitu:
1. Penetuan kadar medroksiprogesteron asetat dalam plasma dengan menggunakan LC-MS elektrospray ionisasi.
Kondisi: metode analisis menggunakan kromatografi cair-spektrometri massa dengan kolom Capcell Pak phenyl UG120 1,5 x 150 mm, 5 m.
Penyiapan sampel dengan cara ekstraksi cair-cair, dengan pelarut pentana dan menggunakan buffer kalium fosfat pH = 7, 100 mM. Fase gerak
pada kromatografi cair adalah komposisi larutan ammonium format dan asetonitril 48:52 vv. Kecepatan alir yang digunakan adalah 0,15
mLmenit. Analisis ini menggunakan internal standar baku dalam yaitu nomegestrol asetat. Kisaran konsentrasi yang digunakan adalah 0,05
– 6 ngmL. Dari penelitian ini, didapatkan hasil waktu retensi 5,7 dan 6,8
menit untuk baku dalam dan medroksiprogesteron asetat, kurva kalibrasi memiliki koefisien korelasi sebesar 0,998, akurasi dan koefisien variasi di
bawah 20. Kim dan D.H. Kim, 1990
2. Penentuan kadar medroksiprogesteron asetat dalam plasma menggunakan GC-MS.
Kondisi: metode analisis menggunakan kromatografi gas-spektrometri massa dengan metode ekstraksi fase padat SPE. Penyiapan sampel dan
baku dalam diekstraksi dengan cara SPE menggunakan larutan elusi etil
asetat. Pemisahan dilakukan dengan kromatografi gas dengan kolom kapiler dan hidrogen sebagai gas pembawanya. Hasil kromatogramnya
muncul di bawah 5 menit, kisaran konsentrasi yang digunakan adalah 5- 2500 pgmL. Hasil validasinya memenuhi persyaratan yang ada pada
petunjuk guidelines FDA untuk validasi metode bioanalisis. Williard et al.
3. Penentuan kadar medroksiprogesteron asetat dalam plasma manusia menggunakan LCMSMS.
Kondisi: metode analisis menggunakan kromatografi cair-spektrometri massa dengan ekstraksi cair-cair. Analit dan baku dalam diekstraksi
dengan campuran larutan n-heksana dan etil asetat. Kisaran konsentrasi yang digunakan adalah 0,01-10 ngmL. Hasil dari penelitian ini adalah
linearitas dengan koefisien korelasi sebesar 0,9995, presisi sebesar 8,6, akurasi sebesar 6,9, dan perolehan kembali dari medroksiprogesteron
asetat sebesar 92 sedangkan baku dalam sebesar 82. Zheng et al.
E. Kromatografi Cair
