BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1 Tempat dan waktu penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Desember 2011 sampai Juni 2012 di kandang pemeliharaan mencit dan Laboratorium Struktur Hewan, Departemen
Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, Medan.
3.2 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah kandang hewan percobaan, jarum gavage, timbangan digital, bak bedah, dissecting set, sample cup, hotplate, oven,
kamera digital, mikrotom, baskom, cover glass, object glass, chumber, mikroskop video mikrometer.
Bahan yang digunakan adalah mencit jantan Mus musculus L. strain DDW,
MSG murni, vitamin C, dan vitamin E produksi Sigma Chemical Co., Castrol Oil produksi PT. Bratako, pakan ternak no. CP 551, alkohol, sekam, larutan Bouin,
akuades, larutan NaCl, pewarna Hematoxylin dan Eosin, canada balsam, xylol, parafin.
3.3 Rancangan Percobaan
Penelitian ini mengikuti Rancangan Acak Lengkap RAL. Terdiri dari 6
perlakuan dan setiap perlakuan terdiri dari 5 ekor mencit Mus musculus L.. Jumlah
Universitas Sumatera Utara
ulangan untuk setiap perlakuan ditentukan dengan menggunakan rumus Frederer Chairul et al., 1992 yaitu: t - 1 n - 1
≥ 15 dimana: t adalah jumlah perlakuan
n adalah jumlah ulangan
Tabel 1. Pemberian Perlakuan Selama 30 Hari
Perlakuan 30 hari
Castrol Oil 0,3 ml
MSG 4 mgg BB
Vit C 0,26 mgg BB
Vit E 0,026 mgg BB
K Negatif -
- -
-
K Positif √
- -
- P1
- √
- -
P2 -
√ √
- P3
√ √
- √
P4 √
√ √
√
Keterangan: - = tidak dicekok
√ = dicekok
3.4 Pelaksanaan Penelitian dan Pengamatan 3.4.1 Hewan Percobaan
Penelitian ini menggunakan mencit Mus musculus L. jantan strain DDW
yang sehat dan fertil serta berumur 8-12 minggu dengan berat 25 g sebanyak 30 ekor, mencit tersebut diperoleh dari Balai Penyidikan Penyakit Hewan Sumatera Utara
Medan dan dibagi dalam perlakuan kontrol K+ dan K- dan perlakuan P1, P2, P3, dan P4. Mencit diberi makan dan minum secara ad-libitum Smith
Mangkoewidjojo, 1988. Kandang mencit dijaga kebersihannya dan diatur 12 jam terang - 12 jam gelap. Penanganan hewan percobaan sesuai dengan persyaratan kode
etik yang berlaku. Diantaranya penanganan dengan penuh kasih sayang, pemberian makanan yang cukup gizi dan sehat serta memperhatikan kebersihan kandangnya.
Sebelum penelitian dilakukan diajukan permohonan untuk mendapatkan ethical clearance ke Komisi Etik Penelitian Hewan di Wilayah Sumatera Utara Medan.
3.4.2 Pembuatan Bahan Uji
Monosodium Glutamat MSG diberikan dengan dosis 4 mgg BB Simanjuntak, 2010. Mencit yang digunakan dengan berat 25 g, maka MSG yang
Universitas Sumatera Utara
dibutuhkan untuk 1 ekor mencit adalah 100 mg dan dilarutkan kedalam akuades sebanyak 0,2 ml. Vitamin C yang diberikan dengan dosis 0,26 mgg BB Simanjuntak,
2010, untuk mencit dengan berat 25 g, maka untuk 1 ekor mencit membutuhkan vitamin C sebanyak 6,5 mg dan dilarutkan kedalam akuades sebanyak 0,2 ml
Sedangkan vitamin E yang diberikan dengan dosis 0,026 mgg BB Anggraini, 2006, maka untuk 1 ekor mencit dengan berat 25 g adalah 0,65 mg, dan dilarutkan kedalam
Castrol Oil hingga 0,3 ml.
3.4.3 Pembuatan Preparat Ginjal Mencit dengan Metode Parafin
Pembuatan sediaan histologi menurut Suntoro 1983, dengan metode parafin adalah: fiksasi, pencucian, dehidrasi, penjernihan, infiltrasi parafin, penanaman, pengirisan,
penempelan, deparafinasi, pewarnaan, penutupan dan pemberian label.
Setelah mencit Mus musculus L. di dislokasi dan dibedah, diambil organ
ginjal kiri dan kanan kemudian dicuci dengan larutan NaCL 0,9, lalu di fiksasi menggunakan larutan fiksatif Bouin selama 1 malam. Setelah proses fiksasi, kemudian
dilakukan pencucian washing dengan menggunakan alkohol 70 dengan cara menggoyang-goyangkan shaker botol yang berisi ginjal hingga jaringan bersih dari
larutan fiksasi. Setelah itu dilakukan dehidrasi, menggunakan alkohol bertingkat dimulai dari alkohol 30, 50, 60, 70, 80, 90, 96 dan 100 alkohol
absolut dengan cara di shaker masing-masing selama 60 menit.
Tahap selanjutnya dilakukan penjernihan clearing menggunakan xylol murni dan di inapkan selama 1 malam. Setelah itu dilakukan infiltrasi, proses infiltrasi ini
dilakukan dalam oven dengan suhu 56ºC, menggunakan perbandingan xylol:parafin, yaitu 3:1, 1:1, dan 1:3, kemudian berakhir di parafin murni I, II dan III masing-masing
selama 1 jam. Setelah proses infiltrasi, selanjutnya dilakukan proses penanaman embedding dalam parafin, sebelum melangkah ke proses ini yang harus disiapkan
adalah mencairkan parafin, membuat kotak-kotak dari karton atau kalender bekas untuk tempat penanaman, menyiapkan lampu spiritus, menyediakan pinset kecil, dan
menyediakan label. setelah semuanya telah siap, proses embedding dimulai dengan
Universitas Sumatera Utara
menuangkan parafin yang telah cair kedalam kotak-kotak karton tadi, selanjutnya ambil organ tersebut dengan cepat dari parafin murni dengan menggunakan pinset
kecil lalu dimasukkan kedalam kotak yang telah berisi parafin cair tadi, biarkan hingga parafin menjadi keras sampai terbentuk blok-blok parafin.
Tahap selanjutnya adalah penyayatan section atau pemotongan dilakukan
dengan memotong blok parafin yang telah ditempelkan pada holder kemudian
dipasang pada mikrotom, lalu mikrotom diputar sampai blok parafin yang berisi organ tadi terpotong menjadi pita-pita parafin dengan ukuran ketebalan 6-10 µm.
Selanjutnya adalah penempelan affiksing dilakukan dengan mengambil beberapa pita paraffin yang telah terpotong dengan menggunakan skapel, kemudian di tempelkan
pada object glass, lalu di celupkan ke dalam air dingin air biasa kemudian ke dalam air panas. Lalu diletakkan di atas hotplate beberapa detik untuk melekatkan pita
parafin ke object glass.
Tahap selanjutnya adalah pewarnaan staining, pewarnaan sediaan ginjal, diwarnai dengan menggunakan pewarna Hematoxylin Eosin. Tahapan pewarnaannya
adalah sebagai berikut: Deparafinasi, dilakukan dengan mencelupkan object glass yang telah berisi irisan jaringan tadi ke dalam xylol selama ± 15 menit.
Dealkoholisasi, dilakukan secara bertingkat dengan alkohol konsentrasi menurun, dengan alkohol absolut, alkohol 96, alkohol 90, alkohol 80, alkohol 70,
alkohol 60, alkohol 50 dan alkohol 30. Pewarnaan, dilakukan dengan cara objek glass yang telah berisi irisan jaringan tadi dimasukkan ke dalam larutan pewarna
Hematoxylin Erlich selama 3-7 menit, dicuci dengan air mengalir ± 10 menit, dimasukkan ke dalam alkohol 30, 50, dimasukkan ke dalam larutan pewarna eosin
0,5 dalam alkohol 70 selama 1-3 menit, preparat dimasukkkan berturut-turut ke dalam alkohol 60, 70, 80, 90, 96, dan alkohol absolut, dikeringkan dengan
kertas pengisap selanjutnya, preparat dimasukkan ke xylol.
Penutupan mounting, setelah dimasukkan ke xylol, jaringan ginjal tersebut kemudian ditetesi canada balsam dan ditutup dengan cover glass dan diusahakan pada
saat penutupan tidak ada gelembung udara. Setelah itu diberi label, dibersihkan dan di lakukan pengamatan di bawah mikroskop.
Universitas Sumatera Utara
3.4.4 Parameter Pengamatan
3.4.4.1 Pengamatan Kualitatif
a. Warna ginjal Penilaian tersebut normal bila permukaan berwarna merah kecoklatan, sedangkan
abnormal jika permukaan menunjukkan perubahan warna.
3.4.4.2 Pengamatan Kuantitatif
a. Berat ginjal Penentuan berat ginjal dilakukan dengan cara menimbang ginjal bagian kanan dan
kiri dengan timbangan digital. Berat kedua ginjal dirata-ratakan dan menjadi rata- rata berat ginjal masing-masing mencit.
b. Kerusakan tubulus proksimal Menurut Sihardo 2006, penghitungan kerusakan tubulus proksimal menggunakan
rumus n m x 100, dimana n adalah jumlah tubulus proksimal yang telah menutup dalam satu lapangan pandang dan m adalah jumlah seluruh tubulus
proksimal dalam satu lapangan pandang. Pada pemeriksaan mikroskopis preparat ginjal, penghitungan dilakukan sampai 5 pergantian lapangan pandang yaitu pada
bagian atas, bawah, tengah, dan antara tengah dengan bagian atas dan bawah preparat. Untuk pengamatan sampai tingkat sel dilakukan pada perbesaran 400x.
Kemudian hasilnya dirata-rata untuk mendapatkan presentase derajat kerusakan ginjal di setiap mencit.
3.5 Analisis Statistik
Untuk data pengamatan histologis data parametrik dilakukan uji normalitas dan uji homogenitas. Jika P0,05 maka ditransformasi kemudian di uji lagi normalitas
dan homogenitasnya. Jika P0,05 dilakukan uji ANOVA 1 arah, dan jika P0,05 dilanjutkan dengan uji Post-Hoc Bouferroni. Tetapi jika data tidak normal dan atau
tidak homogen P0,05 maka dilakukan uji non parametrik Kruskall-wallis. Jika P0,05 dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney.
Universitas Sumatera Utara
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Gambaran Morfologi Ginjal Mencit Mus musculus L.