Pembuatan Bahan Uji Pembuatan Preparat Ginjal Mencit dengan Metode Parafin

ulangan untuk setiap perlakuan ditentukan dengan menggunakan rumus Frederer Chairul et al., 1992 yaitu: t - 1 n - 1 ≥ 15 dimana: t adalah jumlah perlakuan n adalah jumlah ulangan Tabel 1. Pemberian Perlakuan Selama 30 Hari Perlakuan 30 hari Castrol Oil 0,3 ml MSG 4 mgg BB Vit C 0,26 mgg BB Vit E 0,026 mgg BB K Negatif - - - - K Positif √ - - - P1 - √ - - P2 - √ √ - P3 √ √ - √ P4 √ √ √ √ Keterangan: - = tidak dicekok √ = dicekok 3.4 Pelaksanaan Penelitian dan Pengamatan 3.4.1 Hewan Percobaan Penelitian ini menggunakan mencit Mus musculus L. jantan strain DDW yang sehat dan fertil serta berumur 8-12 minggu dengan berat 25 g sebanyak 30 ekor, mencit tersebut diperoleh dari Balai Penyidikan Penyakit Hewan Sumatera Utara Medan dan dibagi dalam perlakuan kontrol K+ dan K- dan perlakuan P1, P2, P3, dan P4. Mencit diberi makan dan minum secara ad-libitum Smith Mangkoewidjojo, 1988. Kandang mencit dijaga kebersihannya dan diatur 12 jam terang - 12 jam gelap. Penanganan hewan percobaan sesuai dengan persyaratan kode etik yang berlaku. Diantaranya penanganan dengan penuh kasih sayang, pemberian makanan yang cukup gizi dan sehat serta memperhatikan kebersihan kandangnya. Sebelum penelitian dilakukan diajukan permohonan untuk mendapatkan ethical clearance ke Komisi Etik Penelitian Hewan di Wilayah Sumatera Utara Medan.

3.4.2 Pembuatan Bahan Uji

Monosodium Glutamat MSG diberikan dengan dosis 4 mgg BB Simanjuntak, 2010. Mencit yang digunakan dengan berat 25 g, maka MSG yang Universitas Sumatera Utara dibutuhkan untuk 1 ekor mencit adalah 100 mg dan dilarutkan kedalam akuades sebanyak 0,2 ml. Vitamin C yang diberikan dengan dosis 0,26 mgg BB Simanjuntak, 2010, untuk mencit dengan berat 25 g, maka untuk 1 ekor mencit membutuhkan vitamin C sebanyak 6,5 mg dan dilarutkan kedalam akuades sebanyak 0,2 ml Sedangkan vitamin E yang diberikan dengan dosis 0,026 mgg BB Anggraini, 2006, maka untuk 1 ekor mencit dengan berat 25 g adalah 0,65 mg, dan dilarutkan kedalam Castrol Oil hingga 0,3 ml.

3.4.3 Pembuatan Preparat Ginjal Mencit dengan Metode Parafin

Pembuatan sediaan histologi menurut Suntoro 1983, dengan metode parafin adalah: fiksasi, pencucian, dehidrasi, penjernihan, infiltrasi parafin, penanaman, pengirisan, penempelan, deparafinasi, pewarnaan, penutupan dan pemberian label. Setelah mencit Mus musculus L. di dislokasi dan dibedah, diambil organ ginjal kiri dan kanan kemudian dicuci dengan larutan NaCL 0,9, lalu di fiksasi menggunakan larutan fiksatif Bouin selama 1 malam. Setelah proses fiksasi, kemudian dilakukan pencucian washing dengan menggunakan alkohol 70 dengan cara menggoyang-goyangkan shaker botol yang berisi ginjal hingga jaringan bersih dari larutan fiksasi. Setelah itu dilakukan dehidrasi, menggunakan alkohol bertingkat dimulai dari alkohol 30, 50, 60, 70, 80, 90, 96 dan 100 alkohol absolut dengan cara di shaker masing-masing selama 60 menit. Tahap selanjutnya dilakukan penjernihan clearing menggunakan xylol murni dan di inapkan selama 1 malam. Setelah itu dilakukan infiltrasi, proses infiltrasi ini dilakukan dalam oven dengan suhu 56ºC, menggunakan perbandingan xylol:parafin, yaitu 3:1, 1:1, dan 1:3, kemudian berakhir di parafin murni I, II dan III masing-masing selama 1 jam. Setelah proses infiltrasi, selanjutnya dilakukan proses penanaman embedding dalam parafin, sebelum melangkah ke proses ini yang harus disiapkan adalah mencairkan parafin, membuat kotak-kotak dari karton atau kalender bekas untuk tempat penanaman, menyiapkan lampu spiritus, menyediakan pinset kecil, dan menyediakan label. setelah semuanya telah siap, proses embedding dimulai dengan Universitas Sumatera Utara menuangkan parafin yang telah cair kedalam kotak-kotak karton tadi, selanjutnya ambil organ tersebut dengan cepat dari parafin murni dengan menggunakan pinset kecil lalu dimasukkan kedalam kotak yang telah berisi parafin cair tadi, biarkan hingga parafin menjadi keras sampai terbentuk blok-blok parafin. Tahap selanjutnya adalah penyayatan section atau pemotongan dilakukan dengan memotong blok parafin yang telah ditempelkan pada holder kemudian dipasang pada mikrotom, lalu mikrotom diputar sampai blok parafin yang berisi organ tadi terpotong menjadi pita-pita parafin dengan ukuran ketebalan 6-10 µm. Selanjutnya adalah penempelan affiksing dilakukan dengan mengambil beberapa pita paraffin yang telah terpotong dengan menggunakan skapel, kemudian di tempelkan pada object glass, lalu di celupkan ke dalam air dingin air biasa kemudian ke dalam air panas. Lalu diletakkan di atas hotplate beberapa detik untuk melekatkan pita parafin ke object glass. Tahap selanjutnya adalah pewarnaan staining, pewarnaan sediaan ginjal, diwarnai dengan menggunakan pewarna Hematoxylin Eosin. Tahapan pewarnaannya adalah sebagai berikut: Deparafinasi, dilakukan dengan mencelupkan object glass yang telah berisi irisan jaringan tadi ke dalam xylol selama ± 15 menit. Dealkoholisasi, dilakukan secara bertingkat dengan alkohol konsentrasi menurun, dengan alkohol absolut, alkohol 96, alkohol 90, alkohol 80, alkohol 70, alkohol 60, alkohol 50 dan alkohol 30. Pewarnaan, dilakukan dengan cara objek glass yang telah berisi irisan jaringan tadi dimasukkan ke dalam larutan pewarna Hematoxylin Erlich selama 3-7 menit, dicuci dengan air mengalir ± 10 menit, dimasukkan ke dalam alkohol 30, 50, dimasukkan ke dalam larutan pewarna eosin 0,5 dalam alkohol 70 selama 1-3 menit, preparat dimasukkkan berturut-turut ke dalam alkohol 60, 70, 80, 90, 96, dan alkohol absolut, dikeringkan dengan kertas pengisap selanjutnya, preparat dimasukkan ke xylol. Penutupan mounting, setelah dimasukkan ke xylol, jaringan ginjal tersebut kemudian ditetesi canada balsam dan ditutup dengan cover glass dan diusahakan pada saat penutupan tidak ada gelembung udara. Setelah itu diberi label, dibersihkan dan di lakukan pengamatan di bawah mikroskop. Universitas Sumatera Utara

3.4.4 Parameter Pengamatan