22 pada DNA eukariot. Materi yang digunakan untuk pembuatan pustaka genom
adalah DNA kromosom. Kloning pustaka cDNA dilakukan untuk mengetahui gen-gen yang mengkode protein dan fungsi protein penyandi gen melalui ekspresi
protein tersebut. Kloning pustaka cDNA sangat penting dilakukan terutama untuk eukariot, karena pada eukariot terdapat intron, yaitu sekuen pada genom yang
tidak menyandi protein. Tidak seperti pada prokariot yang tidak mempunyai intron, pada eukariot diperlukan sintesis cDNA untuk memperoleh gen penyandi
protein tertentu yang terekspresi Ausubel et.al, 1990.
2.5.1. Síntesis cDNA
Sintesis cDNA adalah proses pembuatan copy DNA dengan menggunakan mRNA sebagai cetakan. Hasil sintesis cDNA berupa untai tunggal dan prosesnya
disebut sebagai transkripsi balik atau sintesis cDNA untai pertama. Enzim yang digunakan untuk transkripsi balik disebut ”reverse transcriptase”, yaitu enzim
DNA polimerase yang mentranskripsi RNA untai tunggal menjadi DNA untai tunggal. Enzim ”reverse transcriptase” yang umum dipakai bersumber dari HIV
human imunodeffyciency virus tipe 1, M-MLV Moloney Murine Leukimia virus
, dan AMV yang berasal dari Avian Myeloblastosis virus Protocol anline, 2006
Pemakaian material mRNA secara langsung sebagai sumber gen relatif lebih sulit dilakukan. Hal ini disebabkan molekul RNA bersifat tidak stabil dan
mudah terdegradasi oleh RNAse. Oleh karena itu, pembuatan copy DNA dari mRNA melalui mekanisme transkripsi balik akan sangat memudahkan. cDNA
hanya dapat disintesis dari mRNA. Hal ini disebabkan oleh karena ujung 3’ pada mRNA mempunyai ekor poli-A. Ekor poli-A tersebut akan berkomplementer dan
menempel pada primer oligo dT untuk membentuk untai pertama cDNA.Dale dan Scantz, 2002.
Proses sintesis cDNA dengan sekuens yang lengkap merupakan suatu tahap yang sangat penting, terutama untuk mengidentifikasi, kloning dan
karakterisasi gen-gen yang fungsional. cDNA dari eukariot dapat dikloning ke prokariot seperti E.coli dan diekspresikan atau ditranslasikan menjadi protein
23 tertentu. Pustaka cDNA yang lengkap menggambarkan total protein yang dapat
terekspresi Protocol online, 2006. Protokol PCR telah dikembangkan untuk sintesis cDNA dari ujung 3’ atau
5’ mRNA. Transkripsi balik dengan primer oligo dT menghasilkan untai pertama. Untai kedua cDNA dihasilkan dengan menggunakan enzim Taq DNA
polimerase dan primer yang spesifik. Serangkaian proses amplifikasi dengan mesin PCR berlangsung dan menghasilkan jutaan copy DNA untai ganda Glick,
1998.
2.5.2. Vektor Kloning
Vektor berfungsi sebagai biotransport atau kendaraan yang membawa gen target dan memperbanyak DNA yang dibawanya di dalam sel inang. Beberapa
jenis vektor kloning yang umum dipakai sebagai biotransport adalah plasmid, virus lambda bactheriophage dan cosmid. Pemilihan vektor tersebut tergantung
pada ukuran fragmen DNA yang akan dibawa dan vektor yang paling sering dipergunakan adalah plasmid Brown, 1991.
Plasmid secara umum diperoleh dari bakteri, yaitu berupa DNA untai ganda yang berbentuk bulat atau linier yang terpisah dari kromosom dengan
ukuran yang bervariasi dari 1 kb – 500 kb. Kemampuannya untuk bereplikasi tanpa tergantung pada kromosom induk sangat menguntungkan terkait perannya
sebagai vektor kloning. Replikasi plasmid dimulai dari ORI origin of replication
. Kriteria paling penting yang harus dimiliki plasmid agar dapat secara optimal bekerja sebagai vektor adalah adanya ori, marker seleksi selectable
marker dan situs kloning multiple cloning site. Beberapa sifat fenotip plasmid yang telah berhasil diidentifikasi adalah ketahanan terhadap antibiotik, produksi
antibiotik, degradasi senyawa organik kompleks atau aroma dan lain-lain Glick, 1998.
Plasmid yang digunakan sebagai vektor haruslah berukuran kecil sehingga dapat membawa fragmen DNA asing yang besar dan mudah dikenal oleh peta
restriksi. Terobosan dalam kloning telah memacu pengembangan DNA vektor yang baru yang lebih canggih dengan cara memodifikasi plasmid alam. Plasmid-
plasmid tersebut ditambah atau dikurangi dengan karakteristik tertentu sehingga
24 memudahkan proses kloning Sambrook dan Russel, 2001. Plasmid yang
digunakan untuk penelitian ini adalah pGemT-Easy.
2.5.3. Plasmid pGemT-Easy dan Strategi Ligasi
