Sukrosa Sintase Tempat dan Waktu

20 Keterangan : SUSY : Sukrosa sintase CESA : Selulosa Sintase KOR : Korrigan Sintase PM : Membran Plasma Gambar 3. Model biosintesis selulosa pada Populus sp Joshi et.al.,2004.

2.4. Sukrosa Sintase

Sukrosa sintase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi konversi antara sukrosa dan uridin dipospat membentuk UDP-glukosa dan fruktosa. Dari berbagai penelitian yang terkait aktifitas sukrose sintase pada berbagai jenis tanaman diketahui bahwa sukrose sintase sangat berperan dalam mengatur metabolisme, mengontrol mobilisasi sukrosa ke berbagai jalur metabolisme yang penting, menghasilkan UDP glukosa untuk membentuk dinding sel bersama kompleks selulosa sintase. Enzim ini terlibat dalam biosintesis selulosa dengan menghubungkan UDP-glukosa ke selulosa sintase pada pembentukan dinding sel sekunder pada kapas Amor, et.al. 1995. Sukrosa sintase bersama Kallosa sintase terlibat pada pembentukan tudung akar Hong et.al., 2001 dan dengan β 1-3, 1-4 glukan sintase pada membran golgi Konishi et.al.,2001. Pembentukan UDP glukosa oleh sukrose sintase merupakan mekanisme perlindungan energi ATP untuk pertumbuhan sel karena UDP yang dibentuk dari UDP-glukosa oleh β-glukan sintase dapat diubah kembali menjadi UDP-glukosa oleh sukrose sintase. Penekanan ekspresi sukrosa sintase melalui RNA antisense 21 pada wortel menyebabkan aktifitas sukrose sintase berkurang sehingga kuantitas selulosa juga berkurang. Sebaliknya, ekspresi sukrose sintase dari mutan “mung bean” Vigna radiata didalam Acetobacter xylinum tidak hanya merubah metabolisme sukrosa, tetapi juga meningkatkan produksi selulosa dengan cara mencegah akumulasi UDP selama biosintesis selulosa karena UDP adalah inhibitor selulosa sintase pada A. xylinum. Dengan demikian, akan sangat memungkinkan bagi peneliti untuk menghasilkan tanaman hutan transgenik dengan jumlah selulosa lebih tinggi melalui overekspresi sukrosa sintase Konishi et.al ., 2004.

2.5. Kloning Gen

Kloning gen adalah penggandaan jumlah DNA rekombinan melalui proses perkembangbiakan sel bakteri. Teknik pembuatan DNA rekombinan meliputi pemotongan, pemindahan dan penyisipan gen yang diinginkan ke dalam sel inang. Prinsip dari teknik ini adalah ligasi fragmen DNA ke vektor yang dapat bereplikasi sendiri dalam inang. Sel inang yang digunakan dapat berupa sel bakteri atau sel ragi. Selanjutnya hasil ligasi ditransformasikan ke sel inang untuk mengamplifikasi atau memperbanyak jumlah fragmen DNA gen target. Keberhasilan kloning gen tergantung pada pemilihan dan kemampuan vektor untuk melanjutkan siklus hidupnya serta bereplikasi pada sel inang yang disisipi oleh gen target. Tahap berikutnya adalah proses seleksi transforman, yaitu sel-sel yang mengandung DNA rekombinan. Secara keseluruhan, proses kloning harus melewati 3 tahap, yaitu ligasi, transformasi dan seleksi transforman Brown, 1991. Fragmen DNA gen target dapat diperoleh melalui pustaka DNA. Pustaka DNA terbagi menjadi 2 jenis, yaitu pustaka genom dan pustaka cDNA. Pustaka DNA merupakan kumpulan klon fragmen DNA yang mewakili keseluruhan genom suatu organisme, sedang pustaka cDNA adalah kumpulan klon gen yang mengkode suatu protein. Pemilihan jenis pustaka DNA didasari oleh tujuan kloning yang dilakukan. Kloning pustaka genom dilakukan untuk mengetahui fragmen genom secara utuh, seperti urutan basa nukleotida dari seluruh DNA genom, daerah promoter , daerah exon, dan termasuk intron yang terdapat hanya 22 pada DNA eukariot. Materi yang digunakan untuk pembuatan pustaka genom adalah DNA kromosom. Kloning pustaka cDNA dilakukan untuk mengetahui gen-gen yang mengkode protein dan fungsi protein penyandi gen melalui ekspresi protein tersebut. Kloning pustaka cDNA sangat penting dilakukan terutama untuk eukariot, karena pada eukariot terdapat intron, yaitu sekuen pada genom yang tidak menyandi protein. Tidak seperti pada prokariot yang tidak mempunyai intron, pada eukariot diperlukan sintesis cDNA untuk memperoleh gen penyandi protein tertentu yang terekspresi Ausubel et.al, 1990.

2.5.1. Síntesis cDNA

Sintesis cDNA adalah proses pembuatan copy DNA dengan menggunakan mRNA sebagai cetakan. Hasil sintesis cDNA berupa untai tunggal dan prosesnya disebut sebagai transkripsi balik atau sintesis cDNA untai pertama. Enzim yang digunakan untuk transkripsi balik disebut ”reverse transcriptase”, yaitu enzim DNA polimerase yang mentranskripsi RNA untai tunggal menjadi DNA untai tunggal. Enzim ”reverse transcriptase” yang umum dipakai bersumber dari HIV human imunodeffyciency virus tipe 1, M-MLV Moloney Murine Leukimia virus , dan AMV yang berasal dari Avian Myeloblastosis virus Protocol anline, 2006 Pemakaian material mRNA secara langsung sebagai sumber gen relatif lebih sulit dilakukan. Hal ini disebabkan molekul RNA bersifat tidak stabil dan mudah terdegradasi oleh RNAse. Oleh karena itu, pembuatan copy DNA dari mRNA melalui mekanisme transkripsi balik akan sangat memudahkan. cDNA hanya dapat disintesis dari mRNA. Hal ini disebabkan oleh karena ujung 3’ pada mRNA mempunyai ekor poli-A. Ekor poli-A tersebut akan berkomplementer dan menempel pada primer oligo dT untuk membentuk untai pertama cDNA.Dale dan Scantz, 2002. Proses sintesis cDNA dengan sekuens yang lengkap merupakan suatu tahap yang sangat penting, terutama untuk mengidentifikasi, kloning dan karakterisasi gen-gen yang fungsional. cDNA dari eukariot dapat dikloning ke prokariot seperti E.coli dan diekspresikan atau ditranslasikan menjadi protein 23 tertentu. Pustaka cDNA yang lengkap menggambarkan total protein yang dapat terekspresi Protocol online, 2006. Protokol PCR telah dikembangkan untuk sintesis cDNA dari ujung 3’ atau 5’ mRNA. Transkripsi balik dengan primer oligo dT menghasilkan untai pertama. Untai kedua cDNA dihasilkan dengan menggunakan enzim Taq DNA polimerase dan primer yang spesifik. Serangkaian proses amplifikasi dengan mesin PCR berlangsung dan menghasilkan jutaan copy DNA untai ganda Glick, 1998.

2.5.2. Vektor Kloning

Vektor berfungsi sebagai biotransport atau kendaraan yang membawa gen target dan memperbanyak DNA yang dibawanya di dalam sel inang. Beberapa jenis vektor kloning yang umum dipakai sebagai biotransport adalah plasmid, virus lambda bactheriophage dan cosmid. Pemilihan vektor tersebut tergantung pada ukuran fragmen DNA yang akan dibawa dan vektor yang paling sering dipergunakan adalah plasmid Brown, 1991. Plasmid secara umum diperoleh dari bakteri, yaitu berupa DNA untai ganda yang berbentuk bulat atau linier yang terpisah dari kromosom dengan ukuran yang bervariasi dari 1 kb – 500 kb. Kemampuannya untuk bereplikasi tanpa tergantung pada kromosom induk sangat menguntungkan terkait perannya sebagai vektor kloning. Replikasi plasmid dimulai dari ORI origin of replication . Kriteria paling penting yang harus dimiliki plasmid agar dapat secara optimal bekerja sebagai vektor adalah adanya ori, marker seleksi selectable marker dan situs kloning multiple cloning site. Beberapa sifat fenotip plasmid yang telah berhasil diidentifikasi adalah ketahanan terhadap antibiotik, produksi antibiotik, degradasi senyawa organik kompleks atau aroma dan lain-lain Glick, 1998. Plasmid yang digunakan sebagai vektor haruslah berukuran kecil sehingga dapat membawa fragmen DNA asing yang besar dan mudah dikenal oleh peta restriksi. Terobosan dalam kloning telah memacu pengembangan DNA vektor yang baru yang lebih canggih dengan cara memodifikasi plasmid alam. Plasmid- plasmid tersebut ditambah atau dikurangi dengan karakteristik tertentu sehingga 24 memudahkan proses kloning Sambrook dan Russel, 2001. Plasmid yang digunakan untuk penelitian ini adalah pGemT-Easy.

2.5.3. Plasmid pGemT-Easy dan Strategi Ligasi

pGemT-Easy merupakan vektor plasmid berbentuk linier berukuran 3015 pb Gambar 4. Plasmid ini mempunyai beberapa kelebihan, diantaranya adalah mempunyai ukuran yang relatif kecil, mempunyai ori untuk replikasi dalam E. coli, membawa gen ketahanan untuk ampisilin, dan mempunyai multiple cloning site MCS dengan 19 sisi unik Promega, 2005. Gambar 4. Peta vektor pGemT-Easy Promega, 2005 MCS adalah suatu segmen pada plasmid yang panjangnya beberapa puluh sampai ratusan pasang basa untuk mengenali enzim restriksi tertentu dan merupakan tempat disisipkannya fragmen DNA asing. Situs pengenalan enzim restriksi tersebut, diantaranya EcoR I, BstZ I, Not I dan lain-lain, memudahkan pemutusan gen dari vektor plasmid. Plasmid ini juga mengandung gen lacZ sehingga dapat digunakan untuk seleksi koloni biru putih. Gen lacZ menyandi enzim β-galaktosidase yang mengubah isopropil- β galaktopiranosida IPTG dan substrat 5-bromo-4-kloro-3-indoil- β-galaktosidase X-gal menjadi biru. Apabila gen lacZ disisipi fragmen DNA asing, maka gen lacZ tidak akan terekspresi sehingga koloni berwarna putih Promega, 2005. pGemT-Easy merupakan generasi terbaru plasmid pGem yang didisain secara khusus untuk mengkloning gen dari produk-produk PCR polymerase 25 chain reaction . Salah satu keuntungan penggunaan vektor plasmid pGemT-Easy adalah, plasmid dapat langsung diligasikan ke DNA target tanpa melalui proses restriksi ataupun penambahan adaptor. pGemT-Easy didesain sedemikian rupa dengan penambahan basa timin pada ujung 3’ Vektor ini digunakan pada produk PCR yang proses amplifikasinya menghasilkan basa adenin pada ujung 3’. Basa adenin dari produk PCR akan ‘overhang’ dengan basa timin Produk PCR dengan hasil akhir penambahan basa adenin pada ujung 3’ dapat diperoleh dengan memilih enzim polimerase yang tepat. Beberapa enzim polimerase yang menghasilkan basa adenin pada daerah ujung 3’ diantaranya adalah enzim taq polimerase, Tfl dan Tth Promega, 2005.

2.5.4. Transformasi Bakteri

Transfomasi adalah memasukkan DNA rekombinan hasil ligasi ke dalam sel bakteri, biasanya adalah E. coli. Untuk meningkatkan efisiensi transformasi, beberapa bakteri harus diberi perlakuan fisik atau kimia tertentu yang akan meningkatkan kemampuannya mengambil DNA. Sel-sel yang mengalami perlakuan ini disebut kompeten sel Brown, 1991. Ada empat teknik transformasi vektor ke dalam sel inang yang biasa digunakan, yaitu : 1. Teknik kejut panas, yaitu inkubasi pada suhu 42 C selama 45 detik 2. Elektroporasi, yaitu transfer DNA dengan bantuan medan listrik 3. Biolistik, yaitu penembakan sel target dengan mikro proyektil berkecepatan tinggi. 4. Mikro injeksi, yaitu injeksi DNA secara langsung ke dalam sel target menggunakan jarum yang sangat runcing. Metode transformasi yang digunakan untuk penelitian ini adalah metode kejut panas. DNA adalah molekul yang sangat hidrofil, sehingga secara normal DNA tidak dapat melewati dinding sel bakteri. Agar DNA gen target dapat melewati membran sel bakteri, maka pada metode kejut panas ini bakteri diberi perlakuan khusus dengan CaCl 2 . Komponen ini akan membuat lubang kecil pada dinding sel bakteri dan dengan memberikan kejutan panas pada kompeten sel, maka gen target 26 dapat memasuki sel bakteri. Sel yang telah ditransformasi selanjutnya disebar ke media seleksi Glick, 1998.

2.5.5. Seleksi dan Verifikasi Transforman

Identifikasi sel transforman diseleksi berdasarkan gen penanda seleksi selectable marker yang terdapat pada plasmid. Gen yang biasa digunakan adalah gen ketahanan terhadap antibiotik tertentu dan gen lacZ untuk seleksi biru putih. Seleksi dilakukan dengan menumbuhkan bakteri pada media agar yang mengandung antibiotik dan hanya sel transforman yang mengandung gen ketahanan yang bersumber dari plasmid yang akan bertahan hidup. Untuk seleksi biru putih digunakan media yang mengandung X-gal sebagai substrat dan IPTG sebagai inducer. Dalam proses transformasi, sel kompeten yang dicampur dengan molekul DNA rekombinan akan mengalami 3 kemungkinan, yaitu sel kompeten tidak disisipi molekul DNA apapun, sel kompeten disisipi DNA vektor yang tidak membawa fragmen DNA, sel kompeten disisipi DNA vektor yang membawa fragmen DNA rekombinan. Secara teoretis, pada seleksi berdasarkan koloni biru putih, koloni yang berwarna putih dapat dipastikan merupakan sel yang membawa DNA rekombinan. Untuk meyakinkan hal tersebut, ada langkah berikutnya yang harus dilakukan meliputi isolasi DNA rekombinan, pemotongan DNA dengan enzim restriksi yang digunakan dalam pembuatan DNA rekombinan, pemisahan DNA melalui elektroforesis dan visualisasi DNA Sambrook dan Russel, 2001. 27 BAB III BAHAN DAN METODE

3.1. Tempat dan Waktu

Penelitian ini dilakukan di Puslit Bioteknologi LIPI Cibinong dari bulan Desember 2005 sampai Oktober 2007.

3.2. Bahan Penelitian