34 1 2 3
Gambar 5. Integritas pita RNA 28S dan 18S dari RNA total Keterangan : Nomor 1-6: RNA total batang sengon umur 4 bulan
4.2. Sintesis cDNA
cDNA disintesis melalui proses transkripsi balik riverse transcription dengan menggunakan RNA total sebagai bahan cetakan. Primer yang digunakan
untuk transkripsi balik adalah oligo dT sehingga hanya mRNA yang mengandung poli-A pada ujung 3’ yang akan disintesis menjadi cDNA, sedang
rRNA dan tRNA yang tidak memiliki poli-A pada ujung 3’ tidak dapat membentuk cDNA. Hasil elektroforesis cDNA yang divisualisasikan dari gel
agarose dibawah sinar UV menunjukkan bahwa proses sintesis cDNA berhasil dilakukan. Hal ini dapat dilihat dari kualitas pita cDNA sengon dibandingkan
dengan kontrol RNA dari kit “ready to go RT-PCR” seperti pada Gambar 6.
Gambar 6. Sintesis cDNA dari sengon Keterangan :
1. Kontrol positif, 2. Kontrol negatif, 3. Hasil sintesis cDNA dari RNA
28S 18S
1 2 3 4 5 6
35 Proses PCR untuk mengamplifikasi cDNA menggunakan primer spesifik
juga berhasil dilakukan dan menghasilkan fragmen dengan ukuran 341 pb. Fragmen cDNA yang berukuran 341 pb ini merupakan kandidat fragmen gen
penyandi sukrosa sintase dari tanaman sengon Gambar 7. Fragmen tersebut selanjutnya diisolasi dan dimurnikan dari gel agarose dan diintroduksikan ke
E.coli .
Gambar 7. Pita hasil PCR cDNA Keterangan :
Nomor 1. Marker 1 Kb DNA plus Ladder; 2. Fragmen cDNA
4.3. Kloning Fragmen
Plasmid pGemT-Easy yang mengandung gen lac-Z digunakan sebagai vektor ligasi. Hasil ligasi fragmen sukrosa sintase dengan pGemT-Easy
diintroduksikan ke bakteri E. coli galur DH
5
α dan disebar ke media seleksi yang mengandung ampisilin, IPTG dan X-gal. Koloni E. coli yang mengandung
transforman plasmid rekombinan diseleksi berdasarkan pembentukan koloni biru putih. Koloni E. coli yang berwarna biru tidak mengandung transforman, sehingga
gen lacZ yang menyandi enzim β-galaktosidase masih aktif terekspresi dan
mengubah substrat X-gal yang tidak berwarna menjadi biru. Koloni target adalah koloni putih yang mengandung transforman, dimana gen lacZ disisisipi oleh
fragmen sukrosa sintase sehingga tidak terekspresi dan menyebabkan koloni tetap berwarna putih Gambar 8.
341 pb 2000 pb
1650 pb 1000 pb
850 pb 650 pb
500 pb 400 pb
300 pb 200 pb
100 pb 12000 pb
5000 pb
1 2
36 Konfirmasi koloni putih dengan PCR dilakukan untuk mengetahui
fragmen sukrosa sintase yang menyisip pada pGemT-Easy. PCR koloni yang menghasilkan pita DNA dengan ukuran 341 pb menunjukkan bahwa koloni putih
adalah transforman yang disisipi fragmen sukrosa sintase. Ini berarti, fragmen sukrosa sintase berhasil dikloning ke vektor pGemT-Easy didalam E. coli galur
DH
5
α.
Gambar 8. Koloni E. coli hasil transformasi berupa koloni putih
4.4. Verifikasi Sisipan dan Analisis Situs Pemotongan Enzim Restriksi
