28 menit. Pelet dikeringkan pada suhu ruang , selanjutnya dilarutkan dengan
penambahan 20 µl air bebas RNAse GibcoBRL, 2005.
3.3.2. Sintesis cDNA Gen Sukrosa Sintase Melalui RT PCR
Sintesis cDNA dilakukan dengan metode RT-PCR menggunakan kit ” ready to go RT PCR” dengan prosedur yang sama dengan protokol ready to go
RT PCR dari Amersham Biosciences. Sintesis cDNA dilakukan dengan
mencampurkan 3 µl RNA total 500 ng dengan butiran “ ready to go RT PCR “ yang telah dilarutkan dengan 43,9 µl air bebas RNAse, 1,1 µl primer untai
pertama pd T12-18 konsentrasi 0,5 µgµl, 1 µl primer maju dengan konsentrasi 100 pmoles, dan 1 µl primer mundur 100 pmoles dengan volume akhir 50 µl.
RT-PCR dilakukan alat PCR Perkin Elmer dengan menginkubasi campuran reaksi pada suhu 42
C selama 30 menit dan suhu 95 C selama 5 menit
Amersham Bioscience, 2005. PCR cDNA sukrosa sintase dilakukan dengan kondisi predenaturasi 95
C 5 menit, denaturasi 95 C 0,45 menit, penempelan
primer 54,4 C 0,45 menit, pemanjangan rantai 72
C 1 menit pemanjangan , dan pemanjangan akhir 72
C 5 menit. PCR dilakukan sebanyak 30 siklus Amersham Biosciences, 2005
3.3.3. Elektroforesis Produk PCR
DNA hasil amplifikasi dengan PCR dielektroforesis pada gel agarose konsentrasi 1,5 dengan buffer TAE 1x yang dibuat dari larutan stok TAE 50x
dengan komposisi 242 g Tris base; 57,1 ml asam asetat glasial dan 100 ml 0,5 M EDTA pH 8.0 selama 1 jam pada voltase 50 millivolt. Produk elektroforesis
selanjutnya direndam dalam EtBr selama 15 menit dan visualisasi pita DNA dilakukan dengan menggunakan foto polaroid diatas lampu UV Sambrook dan
Russel, 2001
3.3.4. Isolasi dan Pemurnian cDNA Produk PCR
Isolasi dan pemurnian fragmen cDNA produk PCR dilakukan dengan menggunakan kit Sephaglas BrandPrep dengan prosedur yang sama dengan
protokol Sephaglas BradPrep. Fragmen DNA sukrosa sintase pada gel agarose
29 dipotong dengan pisau steril. Potongan gel dicacah untuk mendapatkan potongan-
potongan gel yang lebih kecil. 200mg gel agarose dilarutkan dengan 250 µl buffer pelarut gel. Campuran gel agarose kemudian divorteks dan diinkubasi pada
suhu 60 C selama 5-10 menit hingga gel agarose larut. Fragmen DNA diikat
dengan menambahkan 5 µl Sephaglas BP, lalu diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang dan disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 30 detik. Pelet
fragmen DNA dibilas dengan buffer pencuci. Selanjutnya pelet dilarutkan dengan 30 µl buffer elusi Amersham Bioscience, 2006.
3.3.5. Kloning cDNA ke dalam Vektor pGemT-Easy
Pengklonan cDNA ke vektor dilakukan dengan cara menginkubasi reaksi ligasi yang terdiri dari campuran 1 µl 50 ng vektor pGemT-Easy, 3µl DNA
hasil purifikasi 10 ngµl, 5 µl 2x buffer T4 DNA ligase, 1 µl T4 DNA ligase dan air bebas RNAse dengan volume akhir 10µl pada suhu 4
C selama semalam Promega, 2005
3.3.6. Transformasi Gen ke E. coli DH5 α
Hasil ligasi fragmen cDNA dimasukkan ke kompeten sel E. coli DH5 α.
Pembuatan kompeten sel bakteri DH5 α dilakukan dengan menggunakan kalsium
klorida. Satu koloni bakteri E. coli DH5 α dikultur dalam 5 ml media LB 10 gl
tripton, 5 gl yeast ekstrak, 5 gl NaCl, pH 7.0 selama semalam dalam inkubator shaker pada 37
C dengan kecepatan 150 rpm. Selanjutnya 0,5 ml kultur ini dimasukkan dalam 5 ml LB dan diinkubasi pada kondisi yang sama hingga
mencapai OD 0,4-0,6. Sebanyak 1 ml kultur ditransfer ke dalam tabung mikro steril dan disentrifugasi pada 5000 rpm, 4
C selama 2 menit. Endapan yang diperoleh ditambah dengan 1 ml larutan 0,1 M CaCl
2
dingin dan disuspensikan. Suspensi disentrifugasi dengan kondisi yang sama dan selanjutnya endapan
disuspensikan kembali dalam 250 µl larutan 0,1 M CaCl
2
dingin. Selanjutnya diinkubasi di es selama 10 menit dan bakteri siap untuk ditransformasi.
Kompeten sel bakteri sebanyak 250 µl dicampur dengan 10 µl 50-100 ng DNA hasil ligasi dengan plasmid dan diinkubasi di es selama 30 menit. Campuran
tersebut kemudian diberi kejutan panas dengan cara diinkubasi pada suhu 42 C
30 selama 45 detik. Kemudian dimasukkan kembali kedalam es selama 1 jam.
Campuran tersebut kemudian diberi kejutan panas kembali pada suhu 42 C
selama 45 detik lalu dimasukkan ke dalam es. Campuran tersebut kemudian ditambah dengan 2 ml media LB dan diinkubasi pada suhu 37
C selama 1 jam. Bakteri disebar pada media seleksi LB yang mengandung 50 mgl ampisilin, 10 µl
0,1M IPTG dan 50 µl X-gal 20 mgml dan diinkubasi pada suhu 37 C selama
semalam Sambrook dan Russel, 2001 Hanya plasmid yang mengandung pGemT-Easy yang dapat hidup pada
media seleksi yang mengandung antibiotik ampisilin. Adanya X-gal dan IPTG akan menghasilkan koloni putih dan biru. Koloni bakteri yang berwarna putih
diisolasi karena mengandung pGemT-Easy rekombinan. Bakteri yang mengandung pGemT-Easy rekombinan tidak mampu menghasilkan
β- galaktosidase sehingga X-gal tidak dapat diuraikan dan koloni tetap berwarna
putih, sedang koloni yang mengandung pGemT-Easy non rekombinan akan berwarna biru karena mampu menguraikan X-gal.
3.3.7. Isolasi DNA Plasmid
