25 chain reaction
. Salah satu keuntungan penggunaan vektor plasmid pGemT-Easy adalah, plasmid dapat langsung diligasikan ke DNA target tanpa melalui proses
restriksi ataupun penambahan adaptor. pGemT-Easy didesain sedemikian rupa dengan penambahan basa timin pada ujung 3’ Vektor ini digunakan pada produk
PCR yang proses amplifikasinya menghasilkan basa adenin pada ujung 3’. Basa adenin dari produk PCR akan ‘overhang’ dengan basa timin Produk PCR dengan
hasil akhir penambahan basa adenin pada ujung 3’ dapat diperoleh dengan memilih enzim polimerase yang tepat. Beberapa enzim polimerase yang
menghasilkan basa adenin pada daerah ujung 3’ diantaranya adalah enzim taq polimerase, Tfl dan Tth Promega, 2005.
2.5.4. Transformasi Bakteri
Transfomasi adalah memasukkan DNA rekombinan hasil ligasi ke dalam
sel bakteri, biasanya adalah E. coli. Untuk meningkatkan efisiensi transformasi,
beberapa bakteri harus diberi perlakuan fisik atau kimia tertentu yang akan meningkatkan kemampuannya mengambil DNA. Sel-sel yang mengalami
perlakuan ini disebut kompeten sel Brown, 1991. Ada empat teknik transformasi vektor ke dalam sel inang yang biasa digunakan, yaitu :
1. Teknik kejut panas, yaitu inkubasi pada suhu 42 C selama 45 detik
2. Elektroporasi, yaitu transfer DNA dengan bantuan medan listrik 3. Biolistik, yaitu penembakan sel target dengan mikro proyektil berkecepatan
tinggi. 4. Mikro injeksi, yaitu injeksi DNA secara langsung ke dalam sel target
menggunakan jarum yang sangat runcing. Metode transformasi yang digunakan untuk penelitian ini adalah metode kejut
panas. DNA adalah molekul yang sangat hidrofil, sehingga secara normal DNA tidak dapat melewati dinding sel bakteri. Agar DNA gen target dapat melewati
membran sel bakteri, maka pada metode kejut panas ini bakteri diberi perlakuan khusus dengan CaCl
2
. Komponen ini akan membuat lubang kecil pada dinding sel
bakteri dan dengan memberikan kejutan panas pada kompeten sel, maka gen target
26 dapat memasuki sel bakteri. Sel yang telah ditransformasi selanjutnya disebar ke
media seleksi Glick, 1998.
2.5.5. Seleksi dan Verifikasi Transforman
Identifikasi sel transforman diseleksi berdasarkan gen penanda seleksi selectable marker yang terdapat pada plasmid. Gen yang biasa digunakan adalah
gen ketahanan terhadap antibiotik tertentu dan gen lacZ untuk seleksi biru putih. Seleksi dilakukan dengan menumbuhkan bakteri pada media agar yang
mengandung antibiotik dan hanya sel transforman yang mengandung gen ketahanan yang bersumber dari plasmid yang akan bertahan hidup. Untuk seleksi
biru putih digunakan media yang mengandung X-gal sebagai substrat dan IPTG sebagai inducer. Dalam proses transformasi, sel kompeten yang dicampur dengan
molekul DNA rekombinan akan mengalami 3 kemungkinan, yaitu sel kompeten tidak disisipi molekul DNA apapun, sel kompeten disisipi DNA vektor yang tidak
membawa fragmen DNA, sel kompeten disisipi DNA vektor yang membawa fragmen DNA rekombinan. Secara teoretis, pada seleksi berdasarkan koloni biru
putih, koloni yang berwarna putih dapat dipastikan merupakan sel yang membawa DNA rekombinan. Untuk meyakinkan hal tersebut, ada langkah berikutnya yang
harus dilakukan meliputi isolasi DNA rekombinan, pemotongan DNA dengan enzim restriksi yang digunakan dalam pembuatan DNA rekombinan, pemisahan
DNA melalui elektroforesis dan visualisasi DNA Sambrook dan Russel, 2001.
27
BAB III BAHAN DAN METODE
3.1. Tempat dan Waktu