27
BAB III BAHAN DAN METODE
3.1. Tempat dan Waktu
Penelitian ini dilakukan di Puslit Bioteknologi LIPI Cibinong dari bulan Desember 2005 sampai Oktober 2007.
3.2. Bahan Penelitian
Bahan tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah jaringan “xylem” batang sengon yang diperoleh dari pohon induk dan anakan sengon
kategori pohon plus dengan nomor koleksi 2 yang berasal dari kebun koleksi plasma nutfah Puslit Bioteknologi LIPI. Plasmid yang digunakan adalah pGemT-
Easy dengan ukuran 3015 pb. Primer yang digunakan adalah primer spesifik untuk sukrosa sintase, yaitu primer maju AACTTGTTGTGCCACAC dan
primer mundur ATA AGA ATGCGGCCGCTCTTTCATTCT CTGTTCCAGA.
3.3. Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap. Skema tahapan metode dapat dilihat pada Lampiran 1.
3.3.1. Isolasi RNA Total Sengon
Isolasi RNA total dilakukan menggunakan kit dan prosedur yang sama dengan protokol reagen Trizol. Sebanyak 0,1 g jaringan “xylem” batang sengon
digerus bersama nitrogen cair hingga halus. Hasil gerusan dimasukkan ke dalam ependorf tube yang berisi 1 ml reagen Trizol lalu diinkubasi selama 10 menit pada
suhu 15-30 C. Campuran disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm pada suhu
4 C selama 15 menit. Supernatan diambil dan diekstraksi dengan 200
μl kloroform kemudian disentrifugasi kembali dengan kecepatan 5000 rpm pada
suhu 4 C selama 15 menit. Ke dalam supernatan ditambahkan 0,5 ml isopropanol
kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm dan suhu 4 C selama 15
menit. Pelet dipisahkan dari supernatan lalu dibilas dengan etanol 70 dingin lalu disentrifugasi kembali dengan kecepatan 5000 rpm pada suhu 4
C selama 15
28 menit. Pelet dikeringkan pada suhu ruang , selanjutnya dilarutkan dengan
penambahan 20 µl air bebas RNAse GibcoBRL, 2005.
3.3.2. Sintesis cDNA Gen Sukrosa Sintase Melalui RT PCR
Sintesis cDNA dilakukan dengan metode RT-PCR menggunakan kit ” ready to go RT PCR” dengan prosedur yang sama dengan protokol ready to go
RT PCR dari Amersham Biosciences. Sintesis cDNA dilakukan dengan
mencampurkan 3 µl RNA total 500 ng dengan butiran “ ready to go RT PCR “ yang telah dilarutkan dengan 43,9 µl air bebas RNAse, 1,1 µl primer untai
pertama pd T12-18 konsentrasi 0,5 µgµl, 1 µl primer maju dengan konsentrasi 100 pmoles, dan 1 µl primer mundur 100 pmoles dengan volume akhir 50 µl.
RT-PCR dilakukan alat PCR Perkin Elmer dengan menginkubasi campuran reaksi pada suhu 42
C selama 30 menit dan suhu 95 C selama 5 menit
Amersham Bioscience, 2005. PCR cDNA sukrosa sintase dilakukan dengan kondisi predenaturasi 95
C 5 menit, denaturasi 95 C 0,45 menit, penempelan
primer 54,4 C 0,45 menit, pemanjangan rantai 72
C 1 menit pemanjangan , dan pemanjangan akhir 72
C 5 menit. PCR dilakukan sebanyak 30 siklus Amersham Biosciences, 2005
3.3.3. Elektroforesis Produk PCR
Kategori