36 Konfirmasi koloni putih dengan PCR dilakukan untuk mengetahui
fragmen sukrosa sintase yang menyisip pada pGemT-Easy. PCR koloni yang menghasilkan pita DNA dengan ukuran 341 pb menunjukkan bahwa koloni putih
adalah transforman yang disisipi fragmen sukrosa sintase. Ini berarti, fragmen sukrosa sintase berhasil dikloning ke vektor pGemT-Easy didalam E. coli galur
DH
5
α.
Gambar 8. Koloni E. coli hasil transformasi berupa koloni putih
4.4. Verifikasi Sisipan dan Analisis Situs Pemotongan Enzim Restriksi
Hasil analisis peta restriksi fragmen DNA sengon menunjukkan bahwa pada fragmen tersebut tidak terdapat situs restriksi untuk enzim EcoR1 seperti
pada plasmid pGemT-Easy. Hal ini tentu saja akan memudahkan pemisahan fragmen DNA sukrosa sintase sengon dari plasmid tersebut. Restriksi fragmen
sukrosa sintase dengan enzim EcoR1 berhasil dilakukan. Hal dapat dilihat dari terbentuknya 2 pita spesifik, yaitu pita pada daerah 3015 pb yang spesifik untuk
plasmid pGemT-Easy dan pita pada daerah 341 pb untuk fragmen sukrosa sintase Gambar 9.
Gambar 9. Hasil restriksi fragmen sukrosa sintase dengan EcoR1; Nomor 1. Restriksi sukrosa sintase; 2. Marker 1 kb plus DNA ladder
3015 pb
341 pb
Koloni biru Koloni tranforman putih
1 2
1000 pb 850 pb
650 pb 500 pb
400 pb 300 pb
200 pb 100 pb
2000 pb 1650 pb
37 Analisis peta situs pemotongan enzim restriksi pada fragmen sukrosa sintase
dibuat dengan program NEB Cutre Gambar 10. Hasil pemetaan enzim restriksi menunjukkan bahwa fragmen sukrosa sintase tidak memiliki situs pemotongan
yang sama dengan situs pemotongan seperti pada plasmid pGemT-Easy. Perbedaan situs tersebut akan memudahkan pemisahan sisipan fragmen DNA
sukrosa sintase dari plasmid pGemT-easy. Peta restriksi sangat bermanfaat untuk menentukan enzim restriksi yang paling tepat untuk pembuatan kontruksi gen dan
pustaka genom.
Gambar 10. Peta restriksi fragmen sukrosa sintase berdasarkan NEB Cutter
4.5. Pengurutan Fragmen Sukrosa Sintase
Hasil pengurutan fragmen Sukrosa sintase menghasilkan 341 pb nukleotida. Basa-basa tersebut menyandi 113 asam amino. Urutan basa nukleotida
38
9 18 27 36 45 54 5 GTG TTA AGG GTG AAG AGG AGA ATT AAT TTG TTC AAG ACT GTG ATA TTG AGA TGT
--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- Val Leu Arg Val Lys Arg Arg Ile Asn Leu Phe Lys Thr Val Ile Leu Arg Cys
63 72 81 90 99 108 CCG AAA ATG GGG CTG CCG GGT GCT AAC TTG TTG TGC CAC ACA GCT TTC ACC CTT
--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- Pro Lys Met Gly Leu Pro Gly Ala Asn Leu Leu Cys His Thr Ala Phe Thr Leu
117 126 135 144 153 162 CCC GTC CTC ACC CGG GTG GTT CAT GGT ATC GAT GTG CTC GAT CCC AAG TTA AAC
--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- Pro Val Leu Thr Arg Val Val His Gly Ile Asp Val Leu Asp Pro Lys Leu Asn
171 180 189 198 207 216 ATT GTT CAC ACG GCG ATG TCA TGT GTA TTT ACT TCC CCT TCA AGA GAA GTT AGC
--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- Ile Val His Thr Ala Met Ser Cys Val Phe Thr Ser Pro Ser Arg Glu Val Ser
225 234 243 252 261 270 AGA TAT CAG GGC CTT GGA AGT CGA TCT GGG AGA AGT TTT AGG AAG GGG AAG GAA
--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- Arg Tyr Gln Gly Leu Gly Ser Arg Ser Gly Arg Ser Phe Arg Lys Gly Lys Glu
279 288 297 306 315 324 AAG AAA ATA GGA TCC GGG ATG AAA AGC GGA ACA AGG CAA ATG TTT TAT AGC AAG
--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- Lys Lys Ile Gly Ser Gly Met Lys Ser Gly Thr Arg Gln Met Phe Tyr Ser Lys
333 GAA TGG ACC GGG CCC CA 3
--- --- --- --- --- -- Glu Trp Thr Gly Pro
DNA dan profil asam amino yang diperoleh dari hasil sekuensing DNA plasmid dapat dilihat pada Gambar 11 .
Gambar 11. Urutan basa nukleotida fragmen sukrosa sintase dan deduksi asam aminonya
4.6. Analisis Homologi Sukrosa Sintase
Urutan basa nukleotida fragmen sukrosa sintase dianalisis dan dibandingkan dengan database gen penyandi sukrosa sintase dari Bank DNA
menggunakan program BLAST Basic Local Alligment Search Tool untuk mengetahui identitas dan tingkat homologinya dengan fragmen dan gen yang telah
diketahui Tabel 2. BLAST adalah program penyejajaran urutan basa nukleotida atau asam amino berdasarkan skor tertinggi Mount, 2001.
39 Tabel 2. Penyejajaran nilai kesamaan basa nukleotida sukrosa sintase
dari beberapa tumbuhan Blastn NCBI, 2007
Kode Sumber Skor
Maks Perbandingan
Sekuen Nilai
E Kesamaan
AB022092.1 Citrus unshiu,
CitSUS1 mRNA untuk sukrosa sintase, cds
komplit 91.5 33
2e-15 78
DQ487290.1 Viscum album
subsp. Album sukrosa sintase mRNA, cds
sebagian 86.0 34
8e-14 76
AY341026.1 Populus tremuloides
sukrosa sintase mRNA, cds komplit
82.4 32 1e-12
76 U73588.2
Gossypium hirsutum sukrosa
sintase mRNA, cds komplit 82.4 36
1e-12 75
AJ311496.1 Pisum sativum
mRNA sukrosa sintase isoform 3 sus3 gene
73.4 31 5e-10
75 NM_122090.3
A. thaliana SUS1 SUKROSA
SINTASE 1; UDP-glikosil transferase sukrosa sintase SUS1
mRNA, cds komplit 69.8 36
6e-09 73
X70990.1 A.thaliana
sukrosa sintase 69.8
36 6e-09
73 D10266.1
Vigna radiata var. radiata vss1
mRNA sukrosa sintase, cds komplit
69.8 32 6e-09
75 AF030231.1
Glycine max sukrosa sintase SS
mRNA, cds komplit 68.0 22
2e-08 79
X69773.1 V. .faba
mRNA sukrosa sintase 64.4
31 3e-07
74
Hasil BLAST basa nukleotida dengan program BLASTN menggunakan fragmen sukrosa sintase yang diperoleh menunjukkan bahwa fragmen sukrosa
sintase sengon memiliki kesamaan urutan basa nukleotida dengan Glycine max, Citrus unshiu, Vigna radiata
dan Arabidopsis thaliana dengan nilai kesamaan berurutan 79, 78, 75 dan 73. Batas standar nilai E expectacy yang dapat
digunakan sebagai batas terendah untuk tingkat kepercayaan pada nilai kesamaan dan homologi antar organisme adalah pangkat -4. Nilai E yang berada pada
range pangkat -7 sampai -15 dari penyejajaran basa nukleotida sengon dibanding organisme lain seperti pada Tabel 2 menunjukkan bahwa tingkat homologi gen
penyandi sukrosa sintase sengon cukup tinggi. Selain BLAST berdasarkan basa nukleotida, juga dilakukan BLAST
berdasarkan deduksi asam amino. Hasil BLAST asam amino yang menyandi protein sukrosa sintase menunjukkan asam amino sengon memiliki tingkat
40 homologi yang mirip dengan Glycine max, Citrus unshiu, Vigna radiata dan
Arabidopsis thaliana dengan nilai berurutan 54.3, 51.2, 54.3 dan 51.6. Tabel 3 .
Tabel 3. Penyejajaran deduksi protein sukrosa sintase dari beberapa Tumbuhan Blastp NCBI, 2007
Kode Sumber Skor Nilai E
P13708 Glycine max
54.3 2e-06 Q01390
Vigna radiata 54.3
2e-06 ABP88869
Medicago sativa 53.9 3e-06
CAB40795.1 Medicago truncatula
53.9 3e-06 CAA09910.1
Pisum sativum 53.9 3e-06
P31926 Vicia faba
53.9 3e-06 CAA50317.1
A. thaliana 51.6 1e-05
BAA89049.1 Citrus unshiu
51.2 2e-05 ABF50715.1
Viscum album 50.8 2e-05
AAD28641.1 Gossypium hirsutum
50.8 2e-05 ABB53602.1
Eucalyptus grandis 50.4 3e-05
AAR03498.1 Populus tremuloides
50.1 3e-05
Hasil BLAST dan penyejajaran menggunakan deduksi asam amino menunjukkan bahwa, gen penyandi sukrosa sintase yang diperoleh dari sengon belum komplit
dan sekuen tersebut berada pada daerah tengah gen penyandi sukrosa sintase dari berbagai spesies yang telah berhasil diidentifikasi Lampiran 2. Untuk itu, masih
perlu dilakukan upaya untuk mendapatkan gen yang utuh.
4.7. Analisis Tingkat Kekerabatan
