24 memudahkan proses kloning Sambrook dan Russel, 2001. Plasmid yang
digunakan untuk penelitian ini adalah pGemT-Easy.
2.5.3. Plasmid pGemT-Easy dan Strategi Ligasi
pGemT-Easy merupakan vektor plasmid berbentuk linier berukuran 3015 pb Gambar 4. Plasmid ini mempunyai beberapa kelebihan,
diantaranya adalah mempunyai ukuran yang relatif kecil, mempunyai ori untuk replikasi dalam E. coli, membawa gen ketahanan untuk ampisilin, dan mempunyai
multiple cloning site MCS dengan 19 sisi unik Promega, 2005.
Gambar 4. Peta vektor pGemT-Easy Promega, 2005 MCS adalah suatu segmen pada plasmid yang panjangnya beberapa puluh
sampai ratusan pasang basa untuk mengenali enzim restriksi tertentu dan merupakan tempat disisipkannya fragmen DNA asing. Situs pengenalan enzim
restriksi tersebut, diantaranya EcoR I, BstZ I, Not I dan lain-lain, memudahkan pemutusan gen dari vektor plasmid. Plasmid ini juga mengandung gen lacZ
sehingga dapat digunakan untuk seleksi koloni biru putih. Gen lacZ menyandi enzim
β-galaktosidase yang mengubah isopropil- β galaktopiranosida IPTG dan substrat 5-bromo-4-kloro-3-indoil-
β-galaktosidase X-gal menjadi biru. Apabila gen lacZ disisipi fragmen DNA asing, maka gen lacZ tidak akan terekspresi
sehingga koloni berwarna putih Promega, 2005. pGemT-Easy merupakan generasi terbaru plasmid pGem yang didisain
secara khusus untuk mengkloning gen dari produk-produk PCR polymerase
25 chain reaction
. Salah satu keuntungan penggunaan vektor plasmid pGemT-Easy adalah, plasmid dapat langsung diligasikan ke DNA target tanpa melalui proses
restriksi ataupun penambahan adaptor. pGemT-Easy didesain sedemikian rupa dengan penambahan basa timin pada ujung 3’ Vektor ini digunakan pada produk
PCR yang proses amplifikasinya menghasilkan basa adenin pada ujung 3’. Basa adenin dari produk PCR akan ‘overhang’ dengan basa timin Produk PCR dengan
hasil akhir penambahan basa adenin pada ujung 3’ dapat diperoleh dengan memilih enzim polimerase yang tepat. Beberapa enzim polimerase yang
menghasilkan basa adenin pada daerah ujung 3’ diantaranya adalah enzim taq polimerase, Tfl dan Tth Promega, 2005.
2.5.4. Transformasi Bakteri
Kategori