3 METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat Pelaksanaan
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari sampai April 2011. Penelitian dilakukan di Laboratorium Biokima Hasil Perairan, Departemen
Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Laboratorium Biologi-Pusat Antar Universitas, Institut Pertanian Bogor, Laboratorium FMIPA
terpadu IPB Baranang Siang, dan Balai Besar Litbang Pertanian Pasca Panen, Cimanggu Bogor.
.
3.2 Bahan dan Alat
Alat yang digunakan pada analisis proksimat adalah blender, plastik, timbangan digital, cawan porselen, oven, desikator, tabung reaksi, gelas
erlenmeyer, tabung kjeldahl, tabung sokhlet, pemanas, destilator, buret dan tanur. Alat yang digunakan dalam analisis asam amino dan adalah oven, syringe, pipet
mikro, timbangan digital, erlenmeyer, water bath, mortar, kertas saring milipore, dan High Performance Liquid Chromatrografi HPLC.
Bahan utama yang digunakan pada penelitian ini adalah kerang bulu segar yang diperoleh dari perairan Muara Angke. Bahan yang digunakan pada analisis
proksimat, asam amino dan taurin adalah akuades, campuran selenium, H
2
SO
4
, NaOH, H
3
BO
3
, HCl 0,01 N, HCl 6 N, pelarut heksana, NaCl, metanol, pikolotiosinat, trietilamin, natrium asetat 1 M, asetonitril 60, buffer natrium
karbonat, larutan methanol, larutan merkaptoetanol, buffer borat 1M, Na-asetat, tetrahidrofuranTHF dan larutan Ortoftalaldehida.
3.3 Metode Penelitian
Tahapan penelitian ini dimulai dengan pengambilan sampel kerang bulu yang berasal dari perairan Muara Angke. Preparasi dan analisis prokismat kerang
bulu dilakukan di laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan, Biokimia Hasil Perairan, dan Biologi Pusat Antar Universitas. Analisis asam amino dilakuakan di
laboratorium FMIPA terpadu Baranang Siang.
3.3.1 Preparasi sampel
Penelitian ini diawali dengan preparasi sampel. Proses preparasi ini bertujuan untuk memudahkan proses pemisahan daging dan jeroan pada sampel.
Sampel yang digunakan dalam penelitian adalah kerang bulu dengan ukuran konsumsi. Kemudian dilakukan penimbangan terhadap daging dan jeroan.
Selanjutnya dilakukan pengujian rendemen. Setelah itu tahap berikutnya dilakukan analisis proksimat baik pada daging maupun jeroan sehingga
menghasilkan data proksimat. Kemudian tahap selanjutnya dilakukan analisis asam amino untuk melihat jenis asam amino pada saja yang terkandung baik pada
daging maupun jeroan. Kerangka penelitian dapat dilihat pada Gambar 5.
Gambar 5 Kerangka penelitian Kerang bulu
Anadara antiquata
Daging Jeroan
Penimbangan dan Perhitungan Rendemen
Analisis Proksimat
Analisis Asam Amino HPLC
Profil Asam Amino Kerang Bulu
3.3.2 Analisis proksimat
Analisis proksimat yang dilakukan terhadap daging kerang bulu meliputi uji kadar air, dan uji kadar abu dengan metode termogravimetri, uji kadar lemak
menggunakan metode sokhlet, uji kadar protein menggunakan metode kjeldahl dan perhitungan kadar karbohidrat dengan cara by difference.
1 Analisis kadar air AOAC 2005
Penentuan kadar air didasarkan pada berat contoh sebelum dan sesudah dikeringkan. Cawan kosong dikeringkan di dalam oven selama 1 jam pada suhu
105
o
C, lalu dimasukkan ke dalam desikator selama 15 menit dan kemudian ditimbang. Sampel sebanyak 1 gram dimasukkan ke dalam cawan lalu
dikeringkan di dalam oven pada suhu 105
o
C sampai beratnya konstan lebih kurang selama 6 jam dan kemudian cawan dimasukkan ke dalam desikator
selama 30 menit selanjutnya ditimbang kembali. Kadar air ditentukan dengan rumus:
Keterangan: A = Berat cawan kosong gram
B = Berat cawan dengan daging kerang bulu gram C = Berat cawan dengan daging kerang bulu setelah dikeringkan gram.
2 Analisis kadar abu AOAC 2005
Cawan dibersihkan dan dikeringkan di dalam oven selama 30 menit dengan suhu 105
o
C, lalu dimasukkan dalam desikator dan kemudian ditimbang. Sampel sebanyak 5 gram ditimbang lalu dimasukkan ke dalam cawan dan
kemudian dibakar di atas kompor listrik sampai tidak berasap lagi dan selanjutnya dimasukkan ke dalam tanur pengabuan dengan suhu 600
o
C selama 7 jam. Cawan dimasukkan di dalam desikator lalu ditimbang. Kadar abu ditentukan dengan
rumus:
3 Analisis kadar lemak AOAC 2005
Daging kerang bulu seberat 2 gram W
1
disebar di atas kapas yang beralaskan kertas saring dan digulung membentuk thimble. Sampel yang telah
dibungkus dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya W
2
dan disambungkan dengan tabung Soxhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung Soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak n-
heksana. Kemudian dilakukan refluks selama 6 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat
destilasi pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan
dalam oven pada suhu 105
o
C, setelah itu labu dimasukkan dalam desikator sampai beratnya konstan W
3
. Kadar lemak ditentukan dengan rumus:
Kadar Lemak = W
3
-W
2
x 100 W
1
Keterangan : W
1
= Berat sampel kerang bulu gram W
2
= Berat labu lemak tanpa lemak gram W
3
= Berat labu lemak dengan lemak gram
4 Analisis kadar protein AOAC 2005
Prinsip dari analisis protein, yaitu untuk mengetahui kandungan protein kasar crude protein pada suatu bahan. Tahap-tahap yang dilakukan dalam
analisis protein terdiri dari tiga tahap, yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. Daging kerang bulu ditimbang seberat 0,5 gram, kemudian dimasukkan ke dalam labu
kjeldahl. Satu butir selenium dimasukkan ke dalam tabung tersebut dan ditambahkan 3 ml H
2
SO
4.
Tabung yang berisi larutan tersebut dimasukkan ke dalam alat pemanas dengan suhu 410
o
C, kemudian ditambahkan 10 ml air. Proses destruksi dilakukan sampai larutan menjadi bening. Larutan yang telah jernih
didinginkan dan kemudian ditambahkan 50 ml akuades dan 20 ml NaOH 40, lalu didestilasi. Hasil destilasi ditampung dalam erlenmeyer 125 ml yang berisi 25
ml asam borat H
3
BO
3
2 yang mengandung indikator bromcherosol green 0,1 dan methyl red 0,1 dengan perbandingan 2:1. Destilasi dilakukan dengan
menambahkan 50 ml larutan NaOH-Na
2
S
2
O
3
ke dalam alat destilasi hingga tertampung 40 ml destilat di dalam erlenmeyer dengan hasil destilat berwarna
hijau kebiruan. Lalu destilat dititrasi dengan HCl 0,09 N sampai terjadi perubahan warna merah muda yang pertama kalinya. Volume titran dibaca dan dicatat.
Larutan blanko dianalisis seperti contoh. Kadar protein dihitung dengan rumus sebagai berikut:
N = mL HCl – mL blanko x N HCl x 14,007 x 100
Mg contoh x faktor koreksi alat Faktor koreksi alat = 2,5
Kadar protein = N x faktor konversi Faktor Konversi
= 6,25
5 Analisis kadar karbohidrat AOAC 2005
Analisis kadar karbohidrat dilakukan secara by difference, yaitu hasil pengurangan dari 100 dengan kadar air, abu, protein, lemak dan serat kasar
sehingga kadar karbohidrat tergantung pada faktor pengurangan. Hal ini karena karbohidrat sangat berpengaruh kepada zat gizi lainnya. Kadar karbohidrat dapat
dihitung dengan menggunakan rumus: Karbohidrat = 100 - abu + air + lemak + protein
3.3.3 Analisis kandungan asam amino
Komposisi asam amino ditentukan dengan menggunakan HPLC. Perangkat HPLC harus dibilas terlebih dahulu dengan eluen yang akan digunakan
selama 2-3 jam. Begitu pula dengan syringe yang akan digunakan dibilas dengan akuades sampai syiringe benar-benar bersih. Analisis asam amino dengan
menggunakan HPLC terdiri dari empat tahap, yaitu: tahap pembuatan hidrolisat protein, tahap pengeringan, tahap derivatisasi dan tahap injeksi serta analisis asam
amino. a.
Tahap pembuatan hidrolisat protein Preparasi sampel, yaitu tahap pembuatan hidrolisat protein, sampel ditimbang
sebanyak 0,1 g dan dihancurkan. Sampel yang telah hancur ditambahkan HCl 6 N sebanyak 10 ml yang kemudian dipanaskan dalam oven pada suhu 100
o
C selama 24 jam. Pemanasan dilakukan untuk mempercepat reaksi hidrolisis.
b. Tahap pengeringan
Sampel disaring dengan dengan kertas saring milipore. Penyaringan ini bertujuan agar larutan yang dihasilkan benar-benar bersih, terpisah dari
padatan. Hasil saringan diambil sebanyak 30 µl dan dikeringkan menggunakan water bath atau evaporator.
c. Tahap derivatisasi
Larutan derivatisasi sebanyak 30 µl ditambahkan pada hasil pengeringan, larutan derivatisasi dibuat dari larutan buffer kalium borat dengan sampel 1:1
kemudian dicampurkan larutan Ortoftalaldehida dengan perbandingan 5:1 dengan sampel.
d. Injeksi ke HPLC
Hasil saringan diambil sebanyak 40 µl untuk diinjeksikan ke dalam HPLC. Perhitungan konsentrasi asam amino yang ada pada bahan dilakukan dengan
pembuatan kromatogram standar dengan menggunakan asam amino yang telah siap pakai yang mengalami perlakuan yang sama dengan sampel.
Kandungan asam amino dalam bahan dapat dihitung dengan rumus: asam amino =
luas area sampel x C x BM x 100 luas area standar x bobot sampel
Keterangan: C = Konsentrasi standar asam amino µgml
BM = Bobot molekul dari masing-masing asam amino gmol Kondisi HPLC pada saat berlangsungnya hidrolisis asam amino adalah
sebagai berikut: Temperatur
: 27
o
C suhu ruang Jenis kolom HPLC
: C-18 ultraspechtere Kecepatan alir eluen : 1 mlmenit
Tekanan : 1 atm
Program : Gradien
Fase gerak : Na asetat dan larutan methanol
Detektor : Floruence
Panjang gelombang : 350-450 nm.
3.3.4 Analisis kandungan taurin AOAC 2005
Kandungan taurin dapat dianalisis menggunakan alat HPLC. Pada pengujian kadar taurin, sampel ditimbang sebanyak 0,5 gram dan dimasukkan ke
dalam tabung ukur 100 ml, kemudian ditambahkan 80 ml air suling dan 1 ml pereaksi carrez lalu dikocok hingga homogen. Selanjutnya dilakukan pengenceran
dengan cara menambahkan air suling sampai tanda tera dan dikocok hingga homogen. Kemudian larutan disaring menggunakan kertas saring whatman. Filtrat
ditampung dalam erlenmeyer dan disimpan di tempat yang gelap. Selanjutnya dilakukan tahap derivatisasi dengan mengambil 1 ml ekstrak
sampel dimasukkan ke labu takar 10 ml, kemudian ditambahkan 1 ml buffer natrium karbonat dan 1 ml larutan dansil klorida. Setelah itu sampel didiamkan
selama 2 jam lalu dikocok dan ditambahkan 0,5 ml laturan metilamin hidroklorida kemudian dikocok kembali hingga homogen. Hasil derivatisasi diambil sebanyak
40 µl kemudian diinjeksikan ke dalam HPLC untuk mengetahui kandungan taurin pada sampel. Kandungan taurin dalam bahan dapat dihitung dengan rumus:
taurin =
Luas area sampel luas area standar
x C x
faktor pengenceran bobot sampel g
Keterangan : C = konsentrasi standar taurin Kondisi alat HPLC saat berlangsungnya analisis taurin sebagai berikut:
Temperatur : 27
o
C suhu ruang Jenis kolom HPLC : Pico tag 3,9 x 150 nm coulumn
Kecepatan alir eluen : 1 mlmenit Tekanan
: 3000 psi Fase gerak
: asetonitril 60 dan buffer natrium asetat 1M Detektor
: UV Panjang gelombang : 272 nm
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Karakteristik Bahan Baku
Kerang bulu yang digunakan pada penelitian ini adalah Anadara antiquata yang berasal dari perairan Muara Angke. Kerang bulu yang digunakan berupa
kerang bulu yang dalam keadaan segar. Daging dan kerang bulu memiliki tekstur lembut dan berwarna agak kecoklatan. Daging dan jeroan kerang bulu segar dapat
dilihat pada Gambar 6.
a b
Gambar 6 Daging kerang bulu a dan b Jeroan kerang bulu Kerang bulu yang digunakan dalam penelitian ini memiliki ciri-ciri:
cangkang tebal dan terdiri atas dua keping, kedua keping cangkang simetris, cangkang berwarna putih ditutupi periostrakum yang berwarna kuning kecoklatan
sampai coklat kehitaman serta terdapat bulu-bulu halus pada bagian sisi cangkangnya, dagingnya lunak dan berwarna oranye, sedangkan isi perut dan
insang berwarna kuning emas. Hasil pengukuran morfometrik kerang bulu disajikan pada Tabel 3.
Tabel 3 Morfometrik kerang bulu Anadara antiquata Parameter cm
Nilai Panjang
4,00 ± 0,41 Lebar
3,03 ± 0,38 Tinggi
2,59 ± 0,28 Berat
18,93 ± 0,23
Keterangan: Data dari 30 sampel kerang bulu
Kerang bulu memiliki panjang rata-rata 4,00 cm; lebar rata-rata 3,03 cm; tinggi rata-rata 2,59 cm dan berat rata-rata sebesar 18,93 g. Perbedaan ukuran dan
berat kerang bulu dapat dipengaruhi oleh pertumbuhan. Pertumbuhan adalah perubahan ukuran, baik berat, panjang maupun volume dalam laju perubahan
waktu. Pertumbuhan dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu faktor internal dan eksternal. Faktor internal merupakan faktor yang sukar untuk dikontrol,
contohnya sifat genetik dan kondisi fisiologi. Sedangkan faktor eksternal merupakan faktor yang dapat dikontrol, di antaranya adalah ketersediaan
makanan, ketersediaan oksigen, komposisi kimia air, sisa metabolisme dan suhu Effendi 1997.
4.2 Proksimat Kerang Bulu Anadara antiquata