Contoh daun Ekstraksi DNA

3.3.1 Contoh daun

Contoh daun yang digunakan adalah daun Shorea laevis yang diambil dari setiap individu pohon sebanyak 20 individu pohon per lokasi, dengan jumlah lokasi sebanyak tujuh lokasi. Sehingga secara keseluruhan contoh daun yang digunakan pada penelitian ini berasal dari 140 individu pohon. Adapun penentuan individu pohon untuk pengambilan contoh daun pada suatu lokasi dilakukan secara acak. Contoh daun S. laevis yang diambil dari setiap lokasi dimasukkan ke dalam plastik yang berisi silika gel. Fungsinya agar daun tetap terjaga kualitasnya sehingga daun menjadi tidak rusak. Selanjutnya daun disimpan di dalam freezer dan setelah dikeluarkan dari freezer maka daun harus segera dilakukan ekstraksi. Menurut Karsinah dalam Husnaeni 2008 hal ini dapat menyebabkan terjadinya pelepasan enzim nuklease yang dapat merusak DNA.

3.3.2 Ekstraksi DNA

Kegiatan ekstraksi DNA dari daun S. laevis dilakukan dengan menggunakan metode CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide Doyle dan Doyle 1990 yang telah dimodifikasi untuk mendapatkan DNA yang cukup murni. Sampel daun 2 x 2 cm digerus dengan menggunakan nitrogen cair di dalam pestel yang bersih. Hasil gerusan selanjutnya dipindahkan ke dalam tube 1,5 ml, lalu hasil gerusan ditambahkan 500-700 mikroliter larutan buffer ekstrak Tris-HCl, EDTA, NaCl, CTAB, Air, dll dan 100 mikroliter PVP 1. Fungsi buffer ekstrak dan PVP adalah mempercepat proses penghancuran. Tahapan selanjutnya dilakukan proses inkubasi di dalam waterbath selama 45 menit-1 jam pada suhu 65 o -70 o C. Apabila proses inkubasi melebihi suhu optimal maka DNA yang ada dalam tube akan rusak. Jika proses inkubasi telah selesai maka tube diangkat dan didinginkan ± 15 menit. Untuk mengikat DNA ditambahkan kloroform 500 mikroliter, selanjutnya campuran tersebut dikocok agar menjadi homogen dan di sentrifuse pada kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit. Proses sentrifugasi dilakukan untuk memisahkan bahan-bahan kimia atau fase organik dari fase air berupa supernatan. Yang digunakan untuk tahapan selanjutnya adalah fase air yang berisi benang-benang nukleat. Untuk itu fase air dipisahkan dari fase organik dengan menggunakan mikro pipet lalu fase air dipindahkan ke dalam tube baru. Kegiatan di atas dilakukan sebanyak dua kali. Selanjutnya ditambahkan isopropanol dingin 500 mikroliter dan NaCl 300 mikroliter, lalu disimpan dalam freezer selama 45 menit sampai 1 jam. Pemberian isopropanol dingin dan garam NaCl akan menyebabkan pengendapan DNA dan terbentuknya benang-benang asam nukleat yang halus berwarna putih. Hasil pengendapan disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit dan cairan dalam tube dibuang. Pembuangan cairan ini harus dilakukan secara hati-hati agar pellet DNA yang mengendap tidak terbuang. Kegiatan selanjutnya adalah proses pencucian DNA dengan menambahkan etanol 95 sebanyak 300 mikroliter, lalu disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit dan cairan dalam tube dibuang dibuang kembali dan dilakukan secara hati- hati. Proses tersebut dilakuakan 2 kali. Pellet DNA yang ada di tube dikeringkan dengan cara disimpan di dalam desikator secara terbalik agar silikagel di dalam desikator dapat menyerap cairan yang ada dalam tube selama ± 15 menit dan setelah itu ditambahkan larutan buffer TE 20 mikroliter, lalu divortek dan disentrifugasi kembali.

3.3.3 Uji Kualitas dan Kuantitas DNA