dipisahkan dari fase organik dengan menggunakan mikro pipet lalu fase air dipindahkan ke dalam tube baru. Kegiatan di atas dilakukan sebanyak dua kali.
Selanjutnya ditambahkan isopropanol dingin 500 mikroliter dan NaCl 300 mikroliter, lalu disimpan dalam freezer selama 45 menit sampai 1 jam. Pemberian
isopropanol dingin dan garam NaCl akan menyebabkan pengendapan DNA dan terbentuknya benang-benang asam nukleat yang halus berwarna putih.
Hasil pengendapan disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit dan cairan dalam tube dibuang. Pembuangan cairan ini harus dilakukan
secara hati-hati agar pellet DNA yang mengendap tidak terbuang. Kegiatan selanjutnya adalah proses pencucian DNA dengan menambahkan etanol 95
sebanyak 300 mikroliter, lalu disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit dan cairan dalam tube dibuang dibuang kembali dan dilakukan secara hati-
hati. Proses tersebut dilakuakan 2 kali. Pellet DNA yang ada di tube dikeringkan dengan cara disimpan di dalam
desikator secara terbalik agar silikagel di dalam desikator dapat menyerap cairan yang ada dalam tube selama ± 15 menit dan setelah itu ditambahkan larutan buffer
TE 20 mikroliter, lalu divortek dan disentrifugasi kembali.
3.3.3 Uji Kualitas dan Kuantitas DNA
Uji kualitas DNA dilakukan dari hasil ekstraksi DNA yang berupa pellet DNA yang telah ditambahkan buffer TE. Uji kualitas DNA ini dilakukan pada gel
agarose dengan konsentrasi sebesar 1 bv, dimana 33 ml buffer TAE 1x dicampurkan dengan 0,33 gram agarose untuk cetakan 17-25 sumur. Campuran
agar 1 tersebut dimasukkan ke erlenmeyer dan dipanaskan ke dalam microwave untuk selanjutnya dituangkan ke dalam cetakan dan ditunggu sampai menjadi
padat, kemudian disimpan di dalam bak elektroforesis yang berisi buffer TAE. Komposisi yang harus dimasukkan ke dalam lubang sumur adalah 3 mikro
liter Blue juice 10x dan 4 mikro liter DNA. Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan aliran listrik dengan tegangan 100 volt sekitar 30 menit. Proses
elektroforesis yang dilakukan secara horizontal, dilihat dari posisi agar pada bak elektroforesisnya. Pada prinsipnya, proses elektroforesis ini dilakukan dengan
memigrasikan DNA dalam gel agarose dari arus - ke arus +. Hasil dari
elektroforesis ini dapat dilihat dengan menggunakan pewarnaan pada larutan Ethidium Bromida EtBr dengan konsentrasi 0,01 vv. Terlebih dahulu gel
agarose direndam dalam larutan EtBr ini selama 15 menit dan selanjutnya pita DNA hasil ekstraksi dilihat dengan menggunakan UV transiluminator dan
didokumentasikan menggunakan kamera untuk difoto. Hasilnya dapat diinterpretasi dan dianalisis.
3.3.4 Polymerase Chain Reaction PCR Mikrosatelit
DNA hasil proses ekstraksi sebelum dilakukan amplifikasi PCR harus dilakukan pengenceran DNA. Pengenceran DNA dilakukan dengan menggunakan
aquabidest. Besarnya perbandingan antara DNA dengan aquabidest tergantung dari tebal dan tipisnya DNA genomik hasil dari ekstraksi.
Prinsip proses PCR adalah suatu siklus berjangka pendek 30-60 detik dengan tiga perubahan suhu yang berubah secara cepat. Komposisi bahan untuk
reaksi PCR mikrosatelit telah ditentukan yang terdiri atas H
2
O, Green go taq, primer forward dan reverse, DNA isolasi. Reaksi PCR mikrosatelit tersebut
dilakukan dengan menggunakan mesin PTC-100 Progammable Thermal Cycler MJ Research, Massachussetts, USA. Komposisi bahan untuk reaksi PCR
Mikrosatelit dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3 Komposisi bahan untuk reaksi PCR Mikrosatelit
No. Nama Bahan
1 sampel reaksi X sample reaksi
1 H
2
O 2 mikro liter
X x 2 mikro liter 2
Green Go Taq 7.5 mikro liter
X x 7.5 mikro liter 3
Primer Forward and Reverse
2 mikro liter X x 2 mikro liter
4 Cetakan DNADNA
isolasi 2 mikro liter
X x 2 mikro liter
Proses mikrosatelit pada daun S. laevis ini dilakukan dengan menggunakan 5 primer spesifik yang telah dipakai untuk jenis Shorea leprosula. Daftar nama-
nama primer spesifik pada pada jenis Shorea leprosula dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4 Primer spesifik pada jenis Shorea leprosula Ng 2008
No. Lokus Repeat PCR Primer 5’ to 3’
PCR Product
Length Annealing
Temp C
1. Sle01
AT
12
F:TCGTACTGATAATCGG R:GTTTATAGGCTGATAATATGATTTA
179- 188
45
2. Sle02
AGC9 F:GGAGGAGAGAAACGAAG R:GTTTGAGGTAGGTAATAACGAGC
142- 160
45
3. Sle05
TA9 F:ACTAATAATGCTTGTGGTAAT
R:GTTTGTAACTAACCTCTAATGCCT 175-
191 45
4. Sle07
GAA7 F:AGAAGAATATGGGTACGAACTG R:GTTTGAATCAACTGGCACCTCTTAT
175- 190
45
5. Sle08
AT12 F:GGCTTCCTTTATATCCAATTT
R:GTTTGAGTTGGCTGCATATGA 177-
197 45
Primer spesifik lainnya yang digunakan untuk S. laevis adalah 5 primer telah digunakan pada jenis Shorea curtisii, tediri atas Shc01, Shc02, Shc03, Shc 04 dan
Shc07. Adapun keterangan lengkap mengenai primer-primer ini dapat dilihat pada Tabel 5.
Tabel 5 Primer spesifik pada jenis Shorea curtisii Ujino et al. 1998
No. Lokus Repeat
PCR Primer 5’ to 3’ PCR
Product Length
Annealing Temp
C
1. Shc01
CT
8
CT CA,CTCA
F:GCTAT TGGCA AGGAT GTTCA R:CTTAT GAGAT CAATT TGACA
G 152
56
2. Shc02
CT
2
CACT
5
F:CACGC TTTCC CAATC TG R:TCAAGA GCAGA ATCCA G
149 54
3. Shc03
CT
8
F:TTGAA GGGAA GGCTA TG R:CTTCT CAACT ACCTT ACC
124 54
4. Shc04
CT
16
F:ATGAG TAACA AGTGA TGAG 96
52
R:TATTG ACGTG GAATC TG
5. Shc07
CT
8
CACT
5
CACCCCTC A
3
CT CA
16
F:ATGTC CATGT TTGAG TG R:CATGG ACATA AGTGG AG
169 54
Proses PCR melalui 3 tahapan yaitu dennaturation, annealing dan extention. Pada proses PCR ini suhu yang digunakan berbeda-beda bergantung pada teknik, bahan
kimia dan primer yang digunakan. Pengaturan suhu pada mesin PTC-100 untuk reaksi mikrosatelit disajikan pada Tabel 6, proses ini dilakukan atau diulang
sebanyak 35 siklus. Tabel 6 Tahapan-tahapan dalam proses PCR Mikrosatelit
Tahapan Suhu
Waktu Jumlah Siklus
Pre-denaturation 95
C 2 menit
1
Denaturation Annealing
Extension 95
C 45
C-56 C
2 menit 1 menit
2 menit
35
Final Extension 72
C 5 menit
1
3.3.5 Pembuatan Gel Poliakrilamid
Beberapa persiapan yang dilakukan sebelum pembuatan gel poliakrilamid.
3.3.5.1 Pencucian piringan kaca
Piringan kaca kecil dicuci dengan 5 ml etanol menggunakan tissue. Kemudian kaca dikeringkan selama 2 menit dan diulang kembali. Kaca tersebut
kemudian diberi perlakuan dengan menggunakan 15 µl ɣ-methacryloxy-
propyltrimethoxyselane Bind Silane, M-6514, Sigma dalam 4 ml etanol dan 1.25 ml asam asetat. Kemudian sisanya dibersihkan dengan tissue yang dilembabkan
dengan etanol. Piringan kaca besar dicuci dengan 5 ml etanol menggunakan tissue kemudian dikeringkan selama 2 menit, dan diulangi kembali.
3.3.5.2 Pembuatan larutan akrilamid
Pembuatan larutan akrilamid dilakukan dengan menyiapkan larutan akrilamid 6. Larutan ini didapatkan dengan menambahkan 5,7 g akrilamid, 0,3
g N N-methylenbisacrylamida pada 100 ml aquades. Pembuatan Gel 6 poliakrilamid; 8 M urea dilakukan dengan mencampur 60 ml urea larutan
akrilamid dalam 10x TBE dengan 500 µl ammonium persulfat dan 50 µl TEMED sigma. Larutan gel diletakkan pada lempengan gel ketebalan 1.5 mm,
selanjutnya gel didiamkan untuk berpolimerisasi selama 30 menit.
3.3.5.3 Loading sample
Hasil amplifikasi kemudian didenaturasi selama 2 menit pada suhu 92
o
C didalam thermocycler dan simpan di lemari es sebelum diaplikasikan ke gel dalam
5 µl yang mengandung volume yang hampir sama dengan larutan akhir 10 mM NaOH, 95 Formamid, 0.05 Bromopheneol Blue, 0.05 Xylene Cyanol.
Kegiatan elektroforesis dilakukan pada 350 V, 40mA, 80 W selama 75 menit setelah pre-run gel selama 1 jam. Buffer untuk running TBE 1x mengandung
18mM Triz-HCl, 8.9 mM asam borat dan 2 mM Na
2
EDTA.
3.3.5.4 Metode Pewarnaan
Metode pewarnaan yang digunakan dalam penelitian ini berdasarkan pada metode penelitian Benbouza et al. 2006 yang dimodifikasi. Metode ini meliputi
beberapa langkah atau tahapan. Setelah dilakukan elektroforesis, gel dicuci dalam 1000 ml air larutan 900 ml aquades, 100 ml etanol 95 dan 50 µ l Asam asetat
dingin selama 5 menit. Tahap selanjutnya adalah mencuci gel dengan melakukan perendaman selama 6-7 menit pada suhu ruangan 22-24
o
C dalam 1000 ml larutan aquades. Impregnasi dengan perak nitrat 1000 ml aquades, 1.5 g Silver
nitrat, 1.5 ml formaldehid 37 dilakukan pada ruangan dengan kondisi cahaya penuh selama 20
– 60 menit. Tahap selanjutnya adalah gel development yaitu dengan menggunakan
larutan campuran dari 1000 ml aquades, 1.5 NaOH, dan 3 ml 37 HCOH sampai pita nampak pada intensitas rendah 3-5 menit. Jika intensitas yang
diharapkan telah nampak pada intensitas rendah 3-5 menit, maka selanjutnya gel diimpregnasi dalam larutan akhir 1000 ml aquades, 10 etanol, dan 0.5 asam
asetat selama 2 menit. Semua tahapan tersebut dilakukan dalam kontainer plastik. Kemudian lembaran gel selanjutnya digerakkan dalam shaker selama proses
pewarnaan. Semua larutan disiapkan dengan menggunakan air ultra pure atau
aquades. Gel selanjutnya dikeringkan pada suhu ruangan dan pita DNA akan secara langsung terlihat dengan bantuan white light box, dan kemudian difoto.
3.8 Analisis Data
Hasil dari kegiatan teknik mikrosatelit pada daun selanjutnya difoto dan dianalisis dengan melakukan skoring pola pita yang muncul. Hasil interpretasi
foto kemudian dianalisis dengan menggunakan software POPGENE 32 Versi 1.31 dan NTSYS Ver 2.0 Rohlf 1998.
Lokus Individu
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 L-1
Lokus Individu
1 2
3 4
5 6
7 8
9 10
11
L-1 12
12 12
22 12
11 12
11 22
11 12
Gambar 4 Cara skoring DNA mikrosatelit Parameter variasi genetik yang dicari dalam penelitian ini adalah sebagai
berikut Finkeldey 2005 dalam Yunanto 2006: 1.
Persentase Lokus Polimorfik PLP =
LM
LP LP
x 100 Keterangan :
ΣLP : jumlah lokus polimorfik ΣLM : jumlah lokus monomorfik
2. Jumlah alel yang diamati n
e
=
Lokus lel
A
3. Jumlah alel yang efektif n
a
=
i
pi
2
1
Keterangan : pi = frekuensi genetik tipe ke i 4. Heterozigitas harapan H
e
= 1-
i
pi
2
Keterangan : pi = frekuensi genetik tipe ke i
