tunggal atau OTUs Original Taxonomic Units biasanya berklaster menjadi beberapa cabang pohon. Analisis klaster dapat digunakan untuk mengetahui
keberadaan hibrid Finkeldey 2005. Variasi genetik tanaman dapat dianalisis menggunakan teknik penanda
genetik sebagai alat bantu mengidentifikasi genotipe suatu individu. Penanda genetik yang terpilih untuk diamati adalah penanda yang terpaut dengan
sifatkarakter yang menjadi sasaran penelitian. Macam penanda genetik yang sering digunakan antara lain penanda morfologi, penanda biokimia atau penanda
isoenzim dan penanda molekuler Finkeldey 2005.
2.5 PCR Polymerase Chain Reaction
Kary B. Mullis mengembangkan Polymerase Chain Reaction PCR pada tahun 1983. Pada mulanya metode untuk menghasilkan penggandaan rantai
spesifik DNA membutuhkan banyak waktu dan mahal. Akan tetapi PCR dapat menghasilkan sejuta kopi dari gen tunggal atau beberapa potong DNA dengan
cepat pada sebuah tabung reaksi kecil. PCR sangat spesifik, dimana rantai DNA target yang diperlukan dapat mencapai kurang dari seperjuta dari total contoh
DNA. Ini berarti bahwa gen tunggal atau potongan kecil DNA termasuk seluruh gen manusia dapat diamplifikasi menggunakan PCR Mader 2001.
Gambar 1 Ilustrasi siklus PCR
Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 20 –30
kali. Setiap siklus terdiri dari tiga tahap. Berikut adalah tiga tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus, yaitu:
1 Tahap peleburan atau denaturasi Pada tahap ini berlangsung pada suhu tinggi, 94
–96°C ikatan hidrogen DNA terputus denaturasi dan DNA menjadi berberkas tunggal. Biasanya pada
tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak lama sampai 5 menit untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA
tidak stabil dan siap menjadi template patokan bagi primer. Durasi tahap ini 1
–2 menit. 2 Tahap penempelan atau annealing
Primer menempel pada bagian DNA template cetakan yang komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 45
–60°C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau
primer menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 1 –2 menit.
Menurut Promega 2003 suhu annealing ditentukan oleh persamaan sebagai berikut:
Tm = 81.5 + 16.6 log M + 0.41 GC – 675n
Keterangan: Tm
= Suhu annealing dalam
o
C M
= Konsentrasi garam dalam buffer mM G
= Banyaknya basa guanin dalam primer yang digunakan C
= Banyaknya basa sitosin dalam primer yang digunakan n
= Panjang primer dalam bp 3 Tahap pemanjangan atau extension
Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA polimerase yang dipakai. Dengan Taq polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76°C. Durasi
tahap ini biasanya 1 menit. Teknik PCR dapat digunakan dengan metode mikrosatelit. Mikrosatelit
terutama sangat berguna untuk studi aliran gen dan sistem perkawinan dari suatu jenis, karena seringkali mikrosatelit menunjukkan variasi yang luas Lefort 1999
diacu dalam Finkeldey 2005.
2.6 Mikrosatelit
