BAB 3 METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan mulai bulan Juni sampai Desember 2014 di Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran, Universitas Sumatera Utara, Medan.
3.2 Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah cairan kantung tertutup dan terbuka, rizosfer serta tumbuhan N. tobaica dan N. gracilis. Bahan pendukung
yang digunakan ialah alkohol 70, agar, spiritus, sodium hipoklorit, ekstrak yeast, media garam 7 gram KH
2
PO
4
, 3 gram K
2
HPO
4
, 0,5 gram MgSO
4
.7 H
2
O,1 gram FeSO
4
.7 H
2
O, 0,01 gram ZnSO
4
, dan 0,01 gram MnCl
2
dalam 500 ml akuadest, koloidal kitin Lampiran 1 halaman 32, kertas cakram, media Nutrient
Agar NA, media Nutrient Broth NB, media uji biokimia, larutan pewarnaan, larutan peyangga TAE, akuabidest, Go Taq® Green Master Mix, primer 16S
rRNA, agarosa, marker DNA 1 kb Thermo Scientific dan etidium bromide EtBr. Alat yang digunakan adalah hockey stick, pipet mikro, ose, cawan petri, tabung
reaksi, bunsen, mikroskop cahaya, spektrofotometer, vorteks, laminar flow, jangka sorong, inkubator, autoklaf, kulkas, penangas, stopwatch, elektroforesis,
mesin PCR, dan tabung eppendorf.
3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1
Isolasi Bakteri Kitinolitik dari Tumbuhan Kantung Semar
Cairan kantung tertutup dan terbuka, rizosfer, serta tumbuhan N. tobaica dan N. gracilis diperoleh dari daerah Merek, Kecamatan Sidikalang, Kabupaten Dairi,
Sumatera Utara. Sampel berupa rizosfer, akar, batang dan kantung dimasukkan secara terpisah ke dalam plastik yang steril, sedangkan sampel berupa cairan
kantung diambil dengan menggunakan spit steril. Sampel disimpan di dalam kotak berisi es dan dibawa ke laboratorium.
Sampel rizosfer sebanyak 5 gram disuspensikan dalam 45 ml larutan fisiologis steril sampai homogen. Berdasarkan metode Barzanti et al. 2007 yang
dimodifikasi, sampel akar, batang, dan kantung terlebih dahulu dipotong lalu dicuci dengan air mengalir selama 20 menit. Permukaan akar, batang, dan kantung
disterilisasi secara berseri dengan cara direndam dalam alkohol 70 selama 2 menit, larutan sodium hipoklorit yang mengandung anion klorin 5,3 selama 10
menit dan alkohol 70 selama 30 detik, selanjutnya dibilas dengan akuadest steril sebanyak 2 kali dan dikeringkan dengan kertas saring steril. Masing-masing
bagian tanaman yang telah disterilisasi permukaan digerus lalu dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang berisi 20 ml media NB secara terpisah kemudian
diinkubasi di penggoyang dengan kecepatan 120 rpm pada suhu ruang 28-30
o
C selama 24 jam.
Masing-masing sampel yang telah diberi perlakuan, serta cairan kantung tertutup dan terbuka diinokulasikan sebanyak 0,1 ml pada media garam minimum
kitin MGMK agar + 0,2 ekstrak yeast dengan metode cawan sebar. Isolat diinkubasi pada suhu 28-30
o
C selama 1-5 hari. Isolat bakteri kitinolitik ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni, setiap koloni disubkultur
sampai diperoleh isolat murni Lampiran 2 halaman 33.
3.3.2 Karakterisasi dan Seleksi Bakteri Kitinolitik
Isolat murni yang memiliki kemampuan kitinolitik dikarakterisasi berdasarkan morfologi koloni, sifat Gram dan sifat biokimia Lampiran 3 halaman
36. Karakterisasi morfologi yang diamati secara makroskopis adalah meliputi bentuk, tepi, elevasi, dan warna koloni. Sedangkan karakterisasi yang diamati
secara mikroskopis meliputi sifat Gram dan bentuk sel. Sifat biokimia yang diamati mencakup uji hidrolisis pati dengan media Starch Agar SA, uji gelatin
dengan media nutrien gelatin, uji motilitas dengan media Sulfide Indole Motility SIM, uji sitrat dengan media
Simmon’s Citrate Agar SCA, uji katalase dengan menggunakan larutan 3 H
2
O
2
, dan uji sulfida dengan media Triple Sugar Iron
Agar TSIA. Untuk uji sitrat, uji gelatin, uji pati, uji motilitas dan uji sulfida biakan terlebih dahulu diinkubasi.
3.3.3 Pengukuran Indeks Kitinolitik
Sebanyak 10 µl suspensi bakteri kitinolitik dalam larutan NaCl 0,85 OD
600
≈ 0,5 diteteskan ke kertas cakram dan diinokulasikan di tengah MGMK agar + 0,2 ekstrak yeast. Biakan diinkubasi selama 7 hari. Indeks kitinolitik
diperoleh berdasarkan perbandingan diameter zona bening di sekitar koloni dengan diameter koloni. Isolat yang memiliki indeks kitinolitik paling tinggi
selama 7 hari inkubasi ditetapkan sebagai isolat terpilih untuk diidentifikasi secara molekuler.
3.3.4 Identifikasi Bakteri Kitinolitik Berdasarkan Gen Penyandi 16S rRNA
Isolasi DNA bakteri kitinolitik dilakukan melalui proses freeze and thaw. Tabung eppendorf 1,5 ml diisi dengan 100 µl akuabidest dalam kondisi aseptis, kemudian
kultur bakteri murni yang berumur 24 jam diambil sebanyak 1 ose dan diinokulasikan ke dalam tabung eppendorf tersebut. Selanjutnya suspensi sel
dibekukan pada suhu -10
o
C sampai larutan mengkristal lalu dicairkan pada suhu 90
o
C selama 10 menit. Pengulangan siklus dilakukan sebanyak 5 kali untuk efisiensi pemecahan sel Nursyirwani Kathy, 2007.
DNA hasil isolasi digunakan untuk amplifikasi gen 16S rRNA yang dilakukan dengan mesin Polymerase Chain Reaction PCR Veriti® 96-Well
Thermal Cycler 4375786, Applied Biosystems, Singapore dengan primer universal spesifik 16S rRNA untuk prokariot, yaitu 63f
5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-
γ’ dan 1387r 5’-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-γ’ Marchesi et al., 1998.
Untuk membuat campuran reaksi PCR dengan volume 25 µl, bahan-bahan berikut dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 0,2 ml: Master Mix 2X 12,5 µl,
primer 63f 10 pmolµl 1 µl , primer 1387r 10 pmolµl 1 µl, DNA template 2 µl, Nuclease Free Water 8,5 µl sehingga volume total 25 µl. Kemudian mesin
PCR diprogramkan dan dijalankan berdasarkan suhu: untuk proses pradenaturasi 94
o
C selama 2 menit, denaturasi 92
o
C selama 30 detik, annealing 55
o
C selama 30
detik, elongasi atau perpanjangan primer 72
o
C selama 1 menit, dan post PCR 72
o
C selama 5 menit. Ketiga proses ini dijalankan sebanyak 30 siklus selama satu jam. Hasil PCR disimpan pada suhu 20
o
C atau langsung dianalisis dengan elektroforesis.
DNA yang telah diamplifikasi dianalisis dengan elektroforesis. Gel elektroforesis disiapkan dengan 1 agarosa 0,35 gram agarosa dalam 35 ml
TAE 1X, dipanaskan dan distirer sampai larut, didinginkan selama 5 menit lalu diteteskan 10 µl EtBr dan dihomogenkan kemudian dituang pada cetakan gel.
Wadah yang sudah berisi gel diberi larutan peyangga TAE 1X secukupnya kemudian masing-masing sampel dan marker DNA 1 kb dimasukkan pada sumur-
sumur gel. Analisis dilakukan pada kondisi 80 volt dan 400 mA selama 50 menit, selanjutnya divisualisasi dengan UV-transluminator.
DNA hasil amplifikasi dikirim ke PT. Biosains Medika Indonesia, Jakarta Selatan untuk dimurnikan dan disekuen oleh Macrogen, Seoul, South Korea
dengan Automated DNA sequencer ABI 3730xl DNA Analyzer, Applied Biosystems. Data sekuen dibandingkan dengan data di GenBank pada database
The National Center for Biotechnology Information NCBI, menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool BLAST.
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Karakteristik Bakteri Kitinolitik dari Tumbuhan Kantung Semar
Sampel tumbuhan kantung semar yang digunakan pada penelitian ini telah diidentifikasi di Herbarium Medanense, Universitas Sumatera Utara, Medan
Lampiran 6 halaman 40. Hasil identifikasi menunjukkan kantung semar yang berwarna merah adalah N. tobaica Danser, sedangkan kantung semar yang
berwarna hijau adalah N. gracilis Korth. Sampel tumbuhan kantung semar dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1 Sampel Tumbuhan Kantung Semar: A. N. tobaica Danser, dan B. N.gracilis Korth
Hasil isolasi bakteri dari cairan kantung tertutup dan terbuka, kantung, batang, akar, serta rizosfer N. tobaica dan N. gracilis yang ditumbuhkan di
MGMK agar + 0,2 ekstrak yeast pada suhu 28-30
o
C selama 1-5 hari, diperoleh 18 isolat bakteri kitinolitik. Karakteristik morfologi dari bentuk koloni, tepi,
elevasi, warna, sifat Gram, dan bentuk sel dari masing-masing isolat dapat dilihat pada Tabel 1.
A B
1:10 1:10
Tabel 1 Karakteristik Morfologi, Sifat Gram dan Bentuk Sel Bakteri Kitinolitik
Bagian Tanaman
Kode Isolat
Morfologi Koloni Sifat
Gram Bentuk
Sel Bentuk
Tepi Elevasi
Warna N. tobaica
Cairan Kantung
Tertutup CtM
Bulat Rata
Rata Putih
+ Bulat
Cairan Kantung
Terbuka CbM
Bulat Rata
Rata Putih
- Batang
Kantung KM
Bulat Rata
Cembung Putih
+ Batang
Batang BM
Tidak beraturan Gelombang
Terangkat Putih
+ Batang
Akar AM1
Bulat Rata
Cembung Hijau metalik
+ Bulat
AM2 Bulat
Berlekuk Rata
Putih Kekuningan
+ Batang
AM3 Tidak beraturan
Gelombang Rata
Putih +
Batang Rizosfer
RM Bulat
Rata Cembung
Putih +
Batang N. gracilis
Cairan Kantung
Tertutup CtH
Tidak beraturan Gelombang
Terangkat Putih
- Batang
Cairan Kantung
Terbuka CbH
Bulat Rata
Cembung Putih
- Batang
Kantung KH
Bulat Gelombang
Rata Putih
+ Batang
Batang BH
Bulat Rata
Rata Putih
Kekuningan
+ Batang
Akar AH1
Bulat Rata
Rata Putih
+ Batang
AH2 Tidak beraturan
Gelombang Rata
Putih +
Batang Rizosfer
RH1 Bulat
Rata Cembung
Putih +
Bulat RH2
Bulat Rata
Cembung Kuning
+ Batang
RH3 Bulat
Rata Cembung
Putih Kekuningan
+ Batang
RH4 Tidak beraturan
Berlekuk Terangkat
Putih +
Batang
Hasil pengamatan Tabel 1 menunjukkan sebanyak 13 isolat koloni yang berbentuk bulat dan 5 isolat koloni berbentuk tidak beraturan, dimana 1 koloni
bertepi berlekuk, dan 4 koloni memiliki tepi gelombang dengan elevasi koloni berbentuk rata dan terangkat. Warna koloni isolat bervariasi dari putih, putih
kekuningan, kuning dan hijau metalik. Pengamatan mikroskopis menunjukkan sebanyak 3 isolat Gram negatif dan 15 isolat Gram positif. Bentuk sel berupa
batang sebanyak 15 isolat, dan bulat sebanyak 3 isolat. Perbedaan warna pada koloni bakteri disebabkan oleh perbedaan pigmen intraseluler yang dihasilkan
oleh bakteri. Pigmen bakteri dapat diklasifikasikan atas karotenoid, antosianin, melanin, tripirilmethenes dan phenazin Leboffe Pierce, 2011.
Dari isolasi bakteri kitinolitik yang telah dilakukan, bakteri kitinolitik asal rizosfer lebih banyak diperoleh daripada bakteri kitinolitik asal bagian tanaman
yang lain. Hal ini mungkin disebabkan karena keberadaan sumber kitin yaitu
eksoskeleton serangga yang mati lebih melimpah di daerah rizosfer daripada di bagian tanaman yang lain maupun di cairan kantung.
Berdasarkan sifat Gram, keragaman bakteri pada tumbuhan kantung semar yang diperoleh dari penelitian ini sejalan dengan beberapa hasil penelitian berikut:
Bohre et al. 2013 yang telah mengisolasi bakteri endofit dari 9 Nepenthes spp., dan diperoleh 57 isolat bakteri Gram positif dari 96 isolat bakteri endofit. Higashi
et al. 1993 mengisolasi 26 isolat bakteri dari cairan 4 kantung N. hybrida, diperoleh 10 isolat Gram positif, dan 16 isolat Gram negatif, diantaranya 10 isolat
memiliki aktivitas hidrolisis kasein. Tan 2011 mengisolasi 3 isolat bakteri kitinolitik Gram negatif dari cairan kantung N. ventrata dan N. reinwardtiana,
yaitu Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloaca, dan Acinetobactor lwofii. Yogiara 2004 juga telah mengisolasi bakteri dari cairan kantung 6 sampel
Nepenthes dari 3 daerah berbeda, diperoleh 27 bakteri yang menghasilkan enzim protease, 34 isolat yang menghasilkan enzim fitase dan 10 isolat yang
menghasilkan enzim kitinase. Dari hasil uji biokimia yang telah dilakukan, semua isolat memiliki
karakteristik uji pati, uji gelatin, uji sitrat, dan uji katalase yang sama, karakteristik uji sulfida dan uji motilitas yang membedakan semua isolat. Hasil
karakterisasi uji biokimia bakteri kitinolitik dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2 Hasil Uji Biokimia Bakteri Kitinolitik
Kode Isolat
Uji Biokimia Pati
Gelatin Sitrat
Sulfida Katalase
Motilitas Warna
Retak Endapan
Hitam Slant
Butt CtM
+ +
+ Kuning
Kuning -
- +
Jonjot + sulfur CbM
+ +
+ Kuning
Kuning +
+ +
Pedang KM
+ +
+ Kuning
Kuning +
+ +
Jonjot + sulfur BM
+ +
+ Kuning
Kuning +
+ +
Jonjot + sulfur AM1
+ +
+ Merah
Kuning +
- +
Pedang AM2
+ +
+ Merah
Kuning -
- +
Pedang AM3
+ +
+ Kuning
Kuning +
- +
Pedang
RM +
+ +
Kuning Kuning
- -
+ Pedang
CtH +
+ +
Merah Merah
+ +
+ Jonjot + sulfur
CbH +
+ +
Kuning Kuning
+ +
+ Pedang
KH +
+ +
Kuning Kuning
+ +
+ Jonjot + sulfur
BH +
+ +
Kuning Kuning
+ +
+ Jonjot + sulfur
AH1 +
+ +
Kuning Kuning
+ +
+ Jonjot + sulfur
AH2 +
+ +
Kuning Kuning
+ +
+ Jonjot + sulfur
RH1 +
+ +
Merah Merah
- -
+ Pedang
RH2 +
+ +
Merah Merah
+ +
+ Pedang
RH3 +
+ +
Merah Merah
+ +
+ Pedang
RH4 +
+ +
Merah Kuning
- -
+ Pedang
Hasil pengamatan Tabel 2 menunjukkan uji positif dari uji pati, uji gelatin, uji sitrat dan uji katalase dari semua isolat. Menurut Leboffe Pierce,
2011, uji positif pati ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni setelah ditetesi lugol, uji positif sitrat ditandai dengan berubahnya medium dari
hijau menjadi biru karena terjadi penghilangan asam dan peningkatan pH dalam media, sedangkan uji positif gelatin ditandai dengan medium gelatin yang tetap
cair setelah dimasukkan ke dalam lemari pendingin selama 30 menit. Hasil uji sulfida menunjukkan 14 isolat yang mengalami perubahan warna, 13 isolat yang
menimbulkan keretakan dan 11 isolat yang menimbulkan endapan hitam. Hasil uji katalase dengan penambahan larutan 3 H
2
O
2
mengindikasikan bahwa semua isolat memiliki enzim katalase, ditandai terbentuknya gelembung udara di sekitar
koloni. Hasil uji motilitas menunjukkan semua isolat bersifat motil, dan terdapat 8 isolat yang menghasilkan sulfur.
Hasil karakterisasi morfologi, sifat Gram, dan uji biokimia menunjukkan karakter isolat yang kurang beragam dari N. tobaica dan N. gracilis. Hal ini
kemungkinan dipengaruhi karena kedua tumbuhan kantung semar ini tumbuh pada tempat yang sama. Rosenblueth Martinez-Romero 2006 menyatakan
beberapa faktor yang mempengaruhi kepadatan populasi bakteri sangat bervariasi pada inang tergantung pada spesies bakteri, genotip inang, tahap perkembangan
inang dan kondisi lingkungan. Isolat yang memiliki kemampuan kitinolitik ditunjukkan dengan
kemampuan menghasilkan zona bening di sekitar koloni pada media MGMK. Hasil isolasi bakteri kitinolitik dari akar N. tobaica AM dan cairan kantung
terbuka N. tobaica CbM dapat dilihat pada Gambar 2. Penggunaan media yang mengandung kitin, misalnya koloidal kitin dapat menginduksi kitinase pada
bakteri, jamur, dan aktinomisetes. Substrat ini mampu menginduksi enzim hidrolitik seperti -1,4-N asetilglukosaminidase, endokitinase dan kitobiosidase
Inbar Chet, 1991. Enzim kitinase akan menghidrolisis kitin menjadi sumber karbon, nitrogen, dan energi bagi bakteri Gooday, 1990.
Gambar 2 Hasil Isolasi Bakteri Kitinolitik dari A. Akar N. tobaica, dan Cairan Kantung Terbuka N. tobaica 1. Zona Hidrolisis 2. Zona Koloni
4.2 Indeks Kitinolitik