kantung diambil dengan menggunakan spit steril. Sampel disimpan di dalam kotak berisi es dan dibawa ke laboratorium.
Sampel rizosfer sebanyak 5 gram disuspensikan dalam 45 ml larutan fisiologis steril sampai homogen. Berdasarkan metode Barzanti et al. 2007 yang
dimodifikasi, sampel akar, batang, dan kantung terlebih dahulu dipotong lalu dicuci dengan air mengalir selama 20 menit. Permukaan akar, batang, dan kantung
disterilisasi secara berseri dengan cara direndam dalam alkohol 70 selama 2 menit, larutan sodium hipoklorit yang mengandung anion klorin 5,3 selama 10
menit dan alkohol 70 selama 30 detik, selanjutnya dibilas dengan akuadest steril sebanyak 2 kali dan dikeringkan dengan kertas saring steril. Masing-masing
bagian tanaman yang telah disterilisasi permukaan digerus lalu dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang berisi 20 ml media NB secara terpisah kemudian
diinkubasi di penggoyang dengan kecepatan 120 rpm pada suhu ruang 28-30
o
C selama 24 jam.
Masing-masing sampel yang telah diberi perlakuan, serta cairan kantung tertutup dan terbuka diinokulasikan sebanyak 0,1 ml pada media garam minimum
kitin MGMK agar + 0,2 ekstrak yeast dengan metode cawan sebar. Isolat diinkubasi pada suhu 28-30
o
C selama 1-5 hari. Isolat bakteri kitinolitik ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni, setiap koloni disubkultur
sampai diperoleh isolat murni Lampiran 2 halaman 33.
3.3.2 Karakterisasi dan Seleksi Bakteri Kitinolitik
Isolat murni yang memiliki kemampuan kitinolitik dikarakterisasi berdasarkan morfologi koloni, sifat Gram dan sifat biokimia Lampiran 3 halaman
36. Karakterisasi morfologi yang diamati secara makroskopis adalah meliputi bentuk, tepi, elevasi, dan warna koloni. Sedangkan karakterisasi yang diamati
secara mikroskopis meliputi sifat Gram dan bentuk sel. Sifat biokimia yang diamati mencakup uji hidrolisis pati dengan media Starch Agar SA, uji gelatin
dengan media nutrien gelatin, uji motilitas dengan media Sulfide Indole Motility SIM, uji sitrat dengan media
Simmon’s Citrate Agar SCA, uji katalase dengan menggunakan larutan 3 H
2
O
2
, dan uji sulfida dengan media Triple Sugar Iron
Agar TSIA. Untuk uji sitrat, uji gelatin, uji pati, uji motilitas dan uji sulfida biakan terlebih dahulu diinkubasi.
3.3.3 Pengukuran Indeks Kitinolitik
Sebanyak 10 µl suspensi bakteri kitinolitik dalam larutan NaCl 0,85 OD
600
≈ 0,5 diteteskan ke kertas cakram dan diinokulasikan di tengah MGMK agar + 0,2 ekstrak yeast. Biakan diinkubasi selama 7 hari. Indeks kitinolitik
diperoleh berdasarkan perbandingan diameter zona bening di sekitar koloni dengan diameter koloni. Isolat yang memiliki indeks kitinolitik paling tinggi
selama 7 hari inkubasi ditetapkan sebagai isolat terpilih untuk diidentifikasi secara molekuler.
3.3.4 Identifikasi Bakteri Kitinolitik Berdasarkan Gen Penyandi 16S rRNA
Isolasi DNA bakteri kitinolitik dilakukan melalui proses freeze and thaw. Tabung eppendorf 1,5 ml diisi dengan 100 µl akuabidest dalam kondisi aseptis, kemudian
kultur bakteri murni yang berumur 24 jam diambil sebanyak 1 ose dan diinokulasikan ke dalam tabung eppendorf tersebut. Selanjutnya suspensi sel
dibekukan pada suhu -10
o
C sampai larutan mengkristal lalu dicairkan pada suhu 90
o
C selama 10 menit. Pengulangan siklus dilakukan sebanyak 5 kali untuk efisiensi pemecahan sel Nursyirwani Kathy, 2007.
DNA hasil isolasi digunakan untuk amplifikasi gen 16S rRNA yang dilakukan dengan mesin Polymerase Chain Reaction PCR Veriti® 96-Well
Thermal Cycler 4375786, Applied Biosystems, Singapore dengan primer universal spesifik 16S rRNA untuk prokariot, yaitu 63f
5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-
γ’ dan 1387r 5’-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-γ’ Marchesi et al., 1998.
Untuk membuat campuran reaksi PCR dengan volume 25 µl, bahan-bahan berikut dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 0,2 ml: Master Mix 2X 12,5 µl,
primer 63f 10 pmolµl 1 µl , primer 1387r 10 pmolµl 1 µl, DNA template 2 µl, Nuclease Free Water 8,5 µl sehingga volume total 25 µl. Kemudian mesin
PCR diprogramkan dan dijalankan berdasarkan suhu: untuk proses pradenaturasi 94
o
C selama 2 menit, denaturasi 92
o
C selama 30 detik, annealing 55
o
C selama 30
detik, elongasi atau perpanjangan primer 72
o
C selama 1 menit, dan post PCR 72
o
C selama 5 menit. Ketiga proses ini dijalankan sebanyak 30 siklus selama satu jam. Hasil PCR disimpan pada suhu 20
o
C atau langsung dianalisis dengan elektroforesis.
DNA yang telah diamplifikasi dianalisis dengan elektroforesis. Gel elektroforesis disiapkan dengan 1 agarosa 0,35 gram agarosa dalam 35 ml
TAE 1X, dipanaskan dan distirer sampai larut, didinginkan selama 5 menit lalu diteteskan 10 µl EtBr dan dihomogenkan kemudian dituang pada cetakan gel.
Wadah yang sudah berisi gel diberi larutan peyangga TAE 1X secukupnya kemudian masing-masing sampel dan marker DNA 1 kb dimasukkan pada sumur-
sumur gel. Analisis dilakukan pada kondisi 80 volt dan 400 mA selama 50 menit, selanjutnya divisualisasi dengan UV-transluminator.
DNA hasil amplifikasi dikirim ke PT. Biosains Medika Indonesia, Jakarta Selatan untuk dimurnikan dan disekuen oleh Macrogen, Seoul, South Korea
dengan Automated DNA sequencer ABI 3730xl DNA Analyzer, Applied Biosystems. Data sekuen dibandingkan dengan data di GenBank pada database
The National Center for Biotechnology Information NCBI, menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool BLAST.
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Karakteristik Bakteri Kitinolitik dari Tumbuhan Kantung Semar
