temperatur annealing, konsentrasi Mg 2
+
, konsentrasi template, dan bahan tambahan seperti bovine serum albumin, triton X-100, gen T4 protein 32,
polietilenglikol 8000 dan gliserol Marchesi et al., 1998. Primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan
diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi - OH pada ujung γ’
yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA. Perancangan primer dapat dilakukan berdasarkan urutan yang telah diketahui ataupun dari urutan protein
yang dituju. Data urutan DNA atau protein bisa didapatkan dari database GenBank. Apabila urutan DNA maupun urutan protein yang dituju belum
diketahui maka perancangan primer dapat didasarkan pada hasil analisis homologi dari urutan DNA atau protein yang telah diketahui mempunyai hubungan
kekerabatan yang terdekat Rychlik, 1995.
2.5 Gen 16S rRNA
Kesulitan dalam
mengkultur mikroba
yang berada
di alam
atau lingkungan, mendorong para ahli mikrobiologi untuk menggunakan gen 16S
rRNA sebagai penanda filogenetik dalam memeriksa keanekaragaman dan mengelompokkan mikroba Kim et al., 2011. Pada prokariotik terdapat tiga jenis
RNA ribosomal, yaitu 5S, 16S, dan 23S rRNA. Di antara ketiganya, 16S rRNA yang paling sering digunakan. Molekul 5S rRNA memiliki urutan basa terlalu
pendek, sehingga tidak ideal dari segi analisis statistika, sementara molekul 23S rRNA memiliki struktur sekunder dan tersier yang cukup panjang sehingga
menyulitkan analisis. Analisis gen penyandi 16S rRNA telah menjadi prosedur baku untuk menentukan hubungan filogenetik dan menganalisis suatu ekosistem
Raghava et al., 2000. Filogenetik menggambarkan klasifikasi secara taksonomi dari suatu
organisme berdasarkan sejarah evolusi maupun karakteristik. Analisis filogenetik sekuen asam amino dan protein menjadi wilayah yang penting dalam analisis
sekuen. Analisis filogenetik dapat digunakan untuk mengikuti perubahan yang terjadi secara cepat yang mampu mengubah suatu spesies, seperti virus
Dharmayanti, 2011.
Gen 16S rRNA dapat digunakan sebagai penanda molekuler karena molekul ini bersifat ubikuitus dengan fungsi yang identik pada seluruh mikroorganisme.
Molekul ini juga dapat berubah sesuai jarak evolusi, sehingga dapat digunakan sebagai kronometer evolusi yang baik. Molekul 16S rRNA memiliki beberapa
daerah yang memiliki urutan basa yang relatif konservatif dan beberapa daerah urutan basa variatif. Perbandingan urutan basa yang konservatif berguna untuk
mengkonstruksi pohon filogenetik universal karena mengalami perubahan relatif lambat dan mencerminkan kronologi evolusi bumi. Sebaliknya, urutan basa yang
bersifat variatif dapat digunakan untuk melacak keragaman dan menempatkan galur-galur dalam satu spesies. Jika urutan basa 16S rRNA menunjukkan derajat
kesamaan yang rendah antara dua taksa, deskripsi suatu takson baru dapat dilakukan tanpa hibridisasi DNA. Biasanya jika derajat kesamaan urutan basa gen
penyandi 16S rRNA kurang dari 97 dapat dianggap sebagai spesies baru Stackebrandt Goebel, 1995.
BAB 3 METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat
