Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Kelapa Sawit EEDKS Hewan Percobaan Pemeriksaan histopatologi

24

3.4 Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Kelapa Sawit EEDKS

Serbuk simplisia diekstraksi dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol 80. Sebanyak 1,2 kg serbuk simplisia dimasukkan ke dalam sebuah bejana, dituangi dengan 9 L 75 bagian etanol, ditutup, dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil sering diaduk, lalu diserkai. Ampasnya di remaserasi dengan etanol secukupnya hingga diperoleh 12 L 100 bagian. Pindahkan maserat ke dalam bejana tertutup, dibiarkan di tempat sejuk terlindung dari cahaya selama 2 hari, enap tuangkan. Pemekatan ekstrak dilakukan dengan alat rotary evaporator pada suhu ±40°C hingga diperoleh ekstrak kental, selanjutnya di freeze dryer pada suhu -40°C hingga diperoleh ekstrak kering Ditjen, POM., 1979. 3.5 Pembuatan Pereaksi 3.5.1 Pembuatan Na-CMC 0,5 Sebanyak 0,5 g Na-CMC ditaburkan dalam lumpang yang berisi 20 ml air suling panas. Ditutup dan didiamkan selama 30 menit hingga diperoleh massa yang transparan, lalu digerus sampai homogen, diencerkan dengan air suling hingga 100 ml.

3.5.2 Pembuatan induksi hiperkolesterol

Sebanyak 10 lemak kambing ditambahkan dan 5 kuning telur bebek, ditambahkan akuades sampai 100, lalu dicampur dan diaduk hingga homogen Dyatmiko, dkk., 2004.

3.5.3 Pembuatan suspensi ekstrak etanol daun kelapa sawit

Dosis yang digunakan pada ekstrak etanol daun kelapa sawit adalah dosis Universitas Sumatera Utara 25 100, 200, 300, dan 400 mgkg BB. Ekstrak etanol daun kelapa sawit masing- masing sebanyak 100, 200, 300, dan 400 mg dimasukkan ke dalam lumpang yang berisi sedikit suspensi Na-CMC 0,5 digerus homogen lalu dicukupkan dengan suspensi Na-CMC 0,5 hingga 10 ml.

3.5.4 Pembuatan suspensi simvastatin dosis 1,3 mgkg bb

Sebanyak 25 mg serbuk simvastatin digerus dalam lumpang, lalu ditambahkan suspensi Na-CMC 0,5 sedikit demi sedikit sambil terus digerus hingga homogen, lalu dicukupkan dengan suspensi Na-CMC hingga 10 ml. Perhitungan dosis simvastatin dapat dilihat pada Lampiran 8 halaman 55.

3.6 Hewan Percobaan

Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian adalah mencit putih jantan dengan berat badan 20-35 g usia 2-3 bulan. Hewan percobaan dikondisikan terlebih dahulu selama 2 minggu sebelum perlakuan dalam kandang yang baik untuk menyesuaikan lingkungannya dan diberikan pakan standar. 3.7 Pengujian Farmakologi 3.7.1 Penyiapan hewan hiperkolesterolemia Hewan yang digunakan dalam penelitian adalah mencit putih jantan yang sehat sebanyak 30 ekor yang terlebih dahulu diadaptasikan dengan lingkungannya. Mencit diberi pakan standar, minum yang cukup, dan kandang dibersihkan 3 kali dalam seminggu selama 14 hari. Diukur kadar kolesterol awal dan dibuat hiperkolesterolemia dengan cara memberi kuning telur dan lemak kambing dosis 1 bb selama 14 hari secara oral lalu diukur kadar kolesterolnya. Universitas Sumatera Utara 26

3.7.2 Pemberian bahan obat terhadap mencit yang hiperkolesterolemia

Hewan uji dibagi menjadi 6 kelompok setiap kelompok terdiri dari 5 hewan uji yang diberikan perlakuan secara per oral. Kelompok 1 diberi suspensi Na-CMC 0,5, kelompok 2-5 diberi suspensi EEDKS dosis 100, 200, 300 dan 400 mgkg bb dan kelompok 6 diberi simvastatin dosis 1,3 mgkg bb. Setiap kelompok mencit ditentukan kadar kolesterol darahnya pada hari ke-7, 14 dan 21 menggunakan alat pengukur kadar kolesterol. Perhitungan dosis pemberian EEDKS dapat dilihat pada Lampiran 8 halaman 55-56.

3.7.3 Pengambilan darah

Mencit dipuasakan terlebih dahulu selama 18 jam. Ekornya dibersihkan dengan etanol 70, dipotong dengan menggunakan gunting bedah. Darah yang keluar disentuhkan pada strip kolesterol yang terpasang pada alat pengukur kadar kolesterol EasyTouch ® GCU.

3.7.4 Pengukuran kadar kolesterol darah mencit

Darah yang keluar disentuhkan pada strip kolesterol yang telah terpasang pada alat pengukur kadar kolesterol EasyTouch ® GCU, tunggu hingga 150 detik hingga muncul angka. Angka yang tampil pada layar alat dicatat sebagai kadar kolesterol darah mgdl.

3.8 Pemeriksaan histopatologi

Organ yang diperiksa secara histopatologi adalah hati. Organ yang sudah dipisahkan dicuci dengan larutan fisiologis 0,9, kemudian dimasukkan dalam larutan dapar formalin 10 dan dibuat preparat histopatologi dengan pewarnaan hematoksilin eosin kemudian diperiksa di bawah mikroskop. Universitas Sumatera Utara 27 Prosedur pembuatan preparat histopatologi: a. Organ yang akan dihistologi direndam didalam larutan dapar formalin 10 pada suhu kamar. b. Organ yang akan dihistologi dipotong, untuk hati dilakukan pemotongan pada lobus terbesar hati. c. Untuk menghilangkan sisa formalin dilakukan pencucian dengan air mengalir. d. Dilakukan proses dehidrasi dengan etanol 70, 80, 90, etanol absolut. Kemudian dilanjutkan dengan penjernihan menggunakan xilen sebanyak tiga kali selama 1 jam. e. Proses penanaman. Caranya: sampel direndam dalam campuran xilen dan parafin cair pada suhu 60 – 70 o C, dengan perbandingan xilen : parafin berturut-turut 3 : 1, 1 : 1, dan 1 : 3 masing-masing selama 2 jam. f. Dilakukan pencetakan dan dibiarkan membeku, kemudian blok parafin dipotong dengan menggunakan alat mikrotom dengan ketebalan irisan 5 - 7 µm. Setelah memperoleh potongan yang bagus, potongan tersebut ditempelkan pada kaca obyek. Sayatan organ yang telah menempel pada kaca obyek segera diletakkan pada permukaan pemanas dengan suhu 56 - 58° C selama kurang lebih 10 detik, sehingga organ meregang dan menempel pada kaca obyek sambil diatur jangan sampai organ berkerut atau melipat. Selanjutnya preparat disimpan dalam suhu kamar untuk dilakukan pewarnaan. g. Pewarnaan dilakukan dengan menggunakan hematoksilin-eosin. Pertama sediaan direndam dengan larutan xilen untuk proses deparafinasi masing- masing selama 12 menit. Kemudian dilakukan proses dehidrasi dengan merendam preparat dalam etanol 70, 80, 90, etanol absolut selama 5 Universitas Sumatera Utara 28 menit, dicuci dengan air mengalir. Selanjutnya direndam dengan larutan hematoksilin selama 5 menit, dicuci dengan air mengalir, dilakukan pewarnaan dengan eosin. Kemudian, dicelupkan ke dalam etanol 70, 80, 90, dan etanol absolut masing-masing selama 10 menit. Terakhir dimasukkan kedalam xilen selama 12 menit. Preparat diamati dibawah mikroskop digital dengan perbesaran 10 x 40.

3.9 Analisis Data