Dari kromatogram KLT diatas dapat diketahui bahwa, fraksi 1 mengalami pemisahan yang cukup jelas terdapat 2 spot , sedangkan
untuk fraksi 2 hanya terdapat 1 spot saja. Diduga senyawa pada fraksi 2 merupakan substrat karena spot yang terbentuk memiliki Rf yang sama
dengan substrat yaitu sebesar 0.4 . Oleh karena itu, untuk isolasi lebih lanjut dengan KLT preparatif digunakan fraksi 1 saja.
5.6 Purifikasi Hasil Biotransformasi Fraksi 1
Untuk memperoleh isolat murni, maka perlu dilakukan purifikasi terhadap hasil biotransformasi. Purifikasi dilakukan dengan menggunakan
KLT preparatif, dimana tujuan dari KLT preparatif sendiri adalah untuk isolasi hingga diperoleh senyawa murni. Sebelum dilakukan preparatif,
harus dipastikan eluen yang digunakan dalam pemisahan harus cocok, sehingga terjadi pemisahan yang cukup jelas. Dalam KLT preparatif ini
ekstrak fraksi 1 di totolkan pada plat KLT dengan ukuran 20 x 10 cm. Dan hasil preparatif dapat dilihat seperti pada Gambar 14.
Gambar 14 . Profil kromatogram KLT preparatif ekstrak metanol fraksi 1 . Fasa diam = silica gel, eluen = etil asetat : isopropanol : amoniak 25
8:8:5 sejumlah 84 ml yang diamati pada panjang gelombang UV 366 nm.
an bawah Lapisan atas
Lapisan tengah 1
Lapisan bawah Lapisan tengah 2
Dari hasil KLT preparatif diperoleh empat lapisan atas, tengah 1, tengah 2 dan bawah, keempat lapisan tersebut kemudian di kerok dan
masing – masing lapisan diekstrak dengan diklorometan, metanol dan klorofom, tujuan adalah untuk menarik secara sempurna senyawa yang
telah dipreparatif. Setelah diperoleh ekstrak pekat dalam masing-masing lapisan tersebut, keempat lapisan tersebut di KLT kembali untuk melihat
apakah isolat tersebut sudah benar-benar murni. Dari hasil KLT keempat lapisan diatas diperoleh nilai Rf yang berbeda pada masing-masing lapisan
seperti pada Tabel 1. Tabel 1. Nilai Rf fraksi 1 setelah di KLT preparatif dengan etilasetat:
isopropanol : amoniak 25 8:8:1 .
No Lapisan
Rf
1 Palmatin
0.4 2
Atas 0.54
3 Tengah 1
0.50 4
Tengah 2 0.52
5 Bawah
0.4
Lapisan pada tabel nomor 2, 3, dan 4 diduga merupakan produk biotransformasi yang berbeda. Hal itu dikarenakan oleh nilai Rf dari ketiga
lapisan tersebut berbeda pula. Sedangkan untuk lapisan bawah no.5 diduga merupakan substrat yang tidak dikonversikan menjadi produk. Hal
itu dikarena Rf lapisan bawah memiliki nilai yang sama dengan Rf palmatin yaitu 0.4.
Dari hasil isolasi pada biotransformasi palmatin oleh jamur AFKR- 3 dalam medium PDB diperoleh 3 produk biotransformasi dengan nilai Rf
serta jumlah yang diperoleh seperti pada Tabel 2.
Tabel 2. Produk biotransformasi palmatin oleh jamur AFKR-3 pada medium PDB Potato Dextro Broth setelah diisolasi dan dipurifikasi.
No Hasil Biotransformasi Rf
Berat mg
1 Produk 1 lapisan atas
0.54 1.6
2 Produk 2 lapisan tengah2
0.52 1.6
3 Produk 3 lapisn tengah 1
0.50 2.1
Jumlah dari ketiga produk yang diperoleh diatas sangat sedikit, hal itu dikarenakan jumlah ekstrak metanol yang dihasilkanya pun sangat
sedikit . Dan untuk mendapatkan produk murni perlu dilakukan preparatif hingga diperoleh senyawa tunggal murni untuk kemudian dapat
dianalisis strukturnya. Produk biotransformasi inilah yang kemudian dianalisis dengan Mass Spektrofotometri.
5.7 Karakterisasi Produk Biotransformasi dengan Spektroskopi Massa
