90, etanol 70, asetonitril, air miliphore, aquabides, larutan dimetil sulfoksida, DMSO, medium Potato Dextro Broth PDB, medium
Potato Dextro Agar PDA.
4.3 Metode Penelitian
Kegiatan yang dilakukan untuk mencapai sasaran :
1. Penyiapan alat dan bahan yang akan digunakan 2. Identifikasi Fraksi 4 Arcangelisia flava L.Merr
3. Biotransformasi palmatin oleh jamur AFKR-3 4. Scaling up biotransformasi palmatin oleh jamur AFKR-3
5. Ekstraksi hasil biotransformasi 6. Partisi ekstrak hasil biotransformasi
7. Fraksinasi ekstrak hasil biotransformasi dengan kromatografi kolom 8. Purifikasi fraksi hasil biotransformasi dengan TLC preparatif
9. Karakterisasi senyawa hasil biotransformasi dengan spektoskopi massa
4.4 Prosedur Kerja
4.4.1 Identifikasi Isolat Fraksi 4 dari Tumbuhan Akar Kuning
Arcangelisia flava L. Merr
Untuk identifikasi isolat fraksi 4 Arcangelisia flava.L Mer yang diduga sebagai senyawa palmatin dilakukan dengan membandingkan
fraksi 4 tersebut dengan standar palmatin HCl. Identifikasi dilakukan dengan kromatografi lapis tipis KLT , HPLC dan spektroskopi
massa. Sebelum dilakukan KLT senyawa palmatin HCl terlebih
dahulu dipreparasi untuk mendapatkan palmatin bebas. Palmatin HCl dilarutkan dengan diklorometan : air 1:1 kemudian ditambahkan
NH
4
OH, dikocok dan didiamkan hingga terbentuk 2 lapisan. Lapisan diklorometan diambil dan dipekatkan. Selanjutnya
ekstrak diklorometan dan fraksi 4 dari Arcangelisia flava. L. Merr dianalisis
dengan KLT, dimana fase gerak yang digunakan adalah diklorometan : metanol 6 : 1 dengan penambahan 1 tetes asam asetat glasial.
Untuk analisis HPLC, kolom yang digunakan adalah Capcell-Pak C- 18 Shiseido, 250 x 4.6 mm. Eluent = asetonitril : air 10:90. Flow
rate : 1.0 mLmin. Detektor UV pada panjang gelombang = 266 nm. Dan untuk analisis dengan spektoskopi massa digunakan LCMS LCT
Premier XE.
4.4.2 Biotransformasi Palmatin oleh Jamur AFKR-3
Dalam penelitian ini strain jamur yang digunakan adalah salah satu isolat jamur filament yang sebelumnya telah diisolasi dari akar kuning
Arcangelisia flava L Merr yaitu jamur AFKR-3. 1. Pembuatan Medium Kultivikasi
Sebanyak 2.4 g medium PBD difco dilarutkan dengan 100 mL air sumur ke dalam erlenmeyer 300 ml , kemudian diaduk hingga
melarut. Erlenmeyer ditutup dengan karet silikon dan selanjutnya medium tersebut disterilkan dengan autoklaf pada temperatur 121°C
selama 20 menit.
2. Kultivasi Jamur Endofit Isolat jamur AFKR-3 yang telah ditumbuhkan pada medium Potato
Dextro Agar PDA dipotong kecil dengan ukuran kurang lebih 0.5 x 0.5 cm sebanyak 4 buah. Kemudian jamur tersebut dipindahkan ke
dalam medium PBD Potato Dextro Broth yang sebelumnya telah disterilkan dan didinginkan. Kultivasi jamur endofit ini di kerjakan
dalam LAF Laminar Air Flow . Medium PDB yang telah berisi jamur endofit tersebut kemudian dishaker pada temperatur 27°C
dengan kecepatan 120 rpm. 3. Penambahan Substrat pada Kultur
Substrat yang ditambahkan pada kultur adalah alkaloid F-4 yang telah diisolasi dari Arcangelisia flava L. Merr senyawa palmatin.
Penambahan substrat dilakukan bertahap sebanyak 2 kali, penambahan yang pertama dilakukan setelah 1 hari kultivasi atau
setelah jamur berumur 1 hari. Sedangkan penambahan substrat yang kedua dilakukan tiga hari kemudian, setelah 4 hari kultivasi. Substrat
yang ditambahkan harus dalam keadaan steril, sehingga dilakukan filtrasi menggunakan Syringe Miller GP dengan dimeter pori 0.02 µm.
Penyaringan dilakukan dalam keadaan steril di Laminar Air Flow. Untuk penambahan substrat yang pertama, sebanyak 1 mL filtrat
dengan konsentrasi 10 metanol dalam 1 mg mL dipipet dan kemudian masing-masing dimasukan ke dalam kultur jamur endofit.
Dan untuk penambahan substrat yang kedua, sebanyak 10 ml substrat 1 mg mL metanol dipipet dan dimasukan ke dalam kultur jamur.
Selanjutnya kultur jamur dan substrat dishaker pada temperatur 27°C dengan kecepatan 120 rpm.
4. Monitoring Hasil Biotransformasi Dalam monitoring hasil biotransformasi dilakukan penyamplingan
terhadap kultur jamur AFKR-3 yang telah ditambahkan substrat. Sampling pertama dilakukan setelah 24 jam penambahan substrat pada
kultur jamurtersebut . Penyamplingan dilakukan dengan memipet 5 ml substrat + kultur yang ada dalam erlenmeyer kemudian dipindahkan
ke dalam tabung reaksi. Setelah itu diekstraksi dengan pelarut dikrlorometan : metanol dengan perbandingan 5:1 sebanyak 5 ml.
Selanjutnya campuran tersebut di vortex dan didiamkan beberapa menit hingga terbentuk dua lapisan. Lapisan bawah kemudian dipipet
dan dipindahkan ke labu evap dan diuapkan. Ekstrak kental kemudian di monitoring dengan TLC absorben : silica gel dan eluen
diklorometan: metanol 6:1 dengan penambahan asam asetat glasial 1 tetes. Selanjutnya, noda yang muncul diamati di bawah sinar UV
pada 254 nm dan 366 nm , dan kemudian disemprot dengan pereaksi dragendorf.
4.4.3 Scaling up Biotransformasi Palmatin oleh Jamur AFKR-3
