Pengukuran Aktivitas Ligninase

4.2.2 Pengukuran Aktivitas Ligninase

Alat

- Spektrofotometer - Kuvet - Sentrifus dan ultrasentrifus - Mikropipet (5 ml, 1 ml, 200 µl, 20 µl)

- Ultrafilter Amicon

Bahan

- Media produksi (Glenn & Gold, 1985, modifikasi) ƒ Larutkan 0,6 g KH 2 PO 4 ; 0,5 g MgSO 4 7H 2 O; 0,4 g K 2 HPO 4 ; 0,1 g NH 4 NO 3 ; 0,1 g KCl; 2 g malt extract ; 10 g serbuk jerami; 10 ml

larutan unsur mikro dengan 1.000 ml akuades. Sterilisasi media produksi pada suhu 121 o

C dan tekanan 0,1 Mpa selama 15 menit. - Larutan unsur mikro

ƒ Larutkan 140 mg MnSO 4 , 40 mg ZnNO 3 .4H 2 O, 1 g Ca(NO 3 ) 2 . 4H 2 O, 60 mg CuSO 4 .5H 2 O berturut-turut dengan 500 ml

akuades dalam labu takar 1.000 ml, lalu cukupkan volume menjadi sampai 1.000 ml.

- Guaiakol 1 mM ƒ Ambil 11,85 µl akuades dari 100 ml akuades dalam botol gelap lalu masukkan ke dalamnya 11,85 µl guaikol (8,94 M), kocok

dengan magnet pengocok. - Bufer McIlvaine (pH 4,5-6), yang terdiri atas: ƒ A: 0,1 M asam sitrat (19,24 g dalam 1.000 ml akuades)

ƒ B: 0,2 M dibasic sodium phosphate (53,65 g Na 2 HPO 4 .7H 2 O dalam 1.000 ml akuades). Sebanyak x ml larutan A dan y ml

larutan B dicampur lalu ditera sampai dengan volume 100 ml dengan akuades.

Akuades (ml) Total (ml) pH

Larutan A

Larutan

(ml)

B (ml)

-H 2 O 2 50 µM

ƒ Ambil 510 µl akuades dari 100 ml akuades dalam botol gelap lalu masukkan ke dalamnya 11,85 µl H 2 O 2 (9,79 M), kocok

dengan magnet pengocok. - MnSO 4 0,2 mM ƒ Larutkan 30,204 g MnSO 4 dengan akuades dalam labu takar

1.000 ml, kemudian cukupkan volumenya menjadi 1.000 ml. - Larutan stok siringaldazina 0,75 mM ƒ Larutkan 0,02703 g dengan etanol 100 ml dan simpan dalam botol gelap. - Bufer natrium tartrat 100 mM pH 3,5 - Veratril alkohol 2 mM

ƒ Larutkan 30 µl veratril alkohol (3,4- dimethoxybenzyl alcohol ) 96% dengan 99,97 ml bufer natrium tartarat 100 mM pH 3,5.

- Bufer glisin-HCl 50 mM, pH 3,0 ƒ Larutkan 3,754 g dengan 950 ml akuades lalu sesuaikan pH larutan dengan menambah HCl pekat tetes demi tetes sampai

mencapai pH 3, kemudian cukupkan volumenya menjadi 1.000 ml dengan akuades.

- ABTS 2,2’- azinobis (3- ethylbenzathiazoline -6- sulfonic acid ) 14 mM

ƒ Larutkan 0,768 g ABTS dengan bufer glisin-HCl 50 mM, pH 3 ƒ lalu cukupkan volumenya menjadi 100 ml dengan bufer yang

sama. - Bufer Sitrat 0,1 M (pH 3,0-4,5)

Larutan terdiri atas: ƒ A : 0,1 M asam sitrat (19,24 g dalam 1.000 ml akuades)

ƒ B : 0,1 M natrium sitrat dihidrat (29,4 g dalam 1.000 ml akuades)

Sebanyak x ml larutan A dan y ml larutan B dicampur lalu ditera sampai dengan volume 100 ml dengan akuades.

Akuades (ml) Total (ml) pH

Larutan A

Larutan B

(ml)

(ml)

Prosedur

33) Penyiapan enzim ekstrak kasar dari Supernatan biakan murni - Tumbuhkan fungi dalam medium produksi enzim Glenn & Gold (1985)

yang dimodifikasi lalu inkubasi pada suhu ruang selama 5 hari. - Sentrifus biakan fungi lalu pekatkan supernatan (mengandung lignin peroksidase) 10 kali dengan ultra filtrasi menggunakan filter yang

menahan massa dengan berat molekul 10 kDa (PM-10; Amicon Div., W. R. Grace & Co.,Danvers, Mass.).

34) Penyiapan enzim ekstrak kasar dari kompos - Siapkan 2,27 kg kompos yang ditumbuhi miselium fungi lalu press dengan

press hidraulik kecil (660 lbs in -2 ) untuk mendapatkan cairan (ekstrak). - Filter cairan (ekstrak kompos) dengan beberapa lembar kain katun

tipis, kemudian partikel-partikelnya dipisahkan dengan sentrifusi 2 kali selama 20 menit pada 13,000 rpm.

- Pekatkan filtrat dengan ultrasentrifusi (Amicon; filter menahan massa

dengan berat molekul 25 kDa). - Dialisis filtrat yang telah dipekatkan terhadap larutan Natrium fosfat 0,01

M (pH 6,8) lalu analisis aktivitas enzim ligninolitik ekstrak kompos.

35) Lakase secara kualitatif dengan plate assay (Srinivasan et al ., 1995) - Metode ini merupakan determinasi cepat untuk mengetahui adanya

lakase dalam supernatan biakan. - Tempatkan medium agarose (0,5%) yang mengandung 14 µmol ABTS

2,2’- azinobis(3-ethylbenzathiazoline-6-sulfonic acid) per ml dalam 50 mM dalam bufer glisin-HCl (pH 3) ke cawan Petri steril (100 x 15 mm).

- Buat 3 lubang (diameter 5mm) pada gel agarose menggunakan ujung

lebar pipet Pasteur steril lalu isi lubang pertama dengan 20 µl larutan biakan uji, lubang kedua dengan 20 µl larutan biakan uji yang dipanaskan pada air mendidih selama 5 menit dan digunakan sebagai kontrol negatif. Kemudian isi lubang ketiga dengan 2 µl lakase dari Pyricularia oryzae (Sigma Chemical Co) sebagai kontrol positif. Terbentuknya warna hijau kebiruan setelah inkubasi selama 1 jam di sekitar sumur dianggap sebagai uji aktivitas lakase positif.

36) Mangan peroksidase (MnP) dengan guaiakol sebagai subtrat (Bonnen et al ., 1994) -

Buat campuran reaksi dengan komposisi I dan II sebagai berikut: Campuran reaksi I

Campuran reaksi II 1 mM guaiakol 1 mM guaiakol Bufer McIlvaine pH 5,5

Bufer McIlvaine pH 5,5 50 µM H 2 O 2 - 0,2 mM MnSO 4 -

ml larutan enzim ml larutan enzim Total volume larutan 5 ml

Total volume larutan 5 ml

- Kocok perlahan campuran reaksi I dan II dengan vortex lalu inkubasi selama 15 menit pada suhu ruang. Untuk kontrol, didihkan masing-masing campuran reaksi selama 60 º

C selama 5 menit. -

Ukur absorbansi campuran reaksi pada panjang gelombang 465 nm sebelum dan sesudah inkubasi. Satu unit aktivitas MnP = unit aktivitas enzim pada campuran reaksi I (aktivitas total) - unit aktivitas pada campuran reaksi II (aktivitas lakase). Satu unit aktivitas MnP didefinisikan dengan jumlah enzim yang diperlukan untuk oksidasi 1 µmol guaiakol per menit. Jumlah guaiakol yang hilang dihitung dengan rumus sbb:

∆c = (A0 – At)/ k . b Keterangan:

∆c = jumlah guaiakol yang hilang selama pengamatan (mol L -1 ) A0 = nilai absorbansi pada awal reaksi

At = nilai absorbansi pada t menit

k = molar absorptivitas guaiakol = 12.000 M -1 cm

b = tebal larutan (1 cm)

Unit aktivitas MnP = (aktivitas total enzim) – (aktivitas lakase)

X vol. larutan total X 10 3 Aktivitas total enzim = menit X vol. larutan enzim (ml)

∆c1 X 10 6

6 ∆c2 X 10 3 X vol. larutan total X 10 Aktivitas lakase =

menit X vol. larutan enzim (ml) Keterangan:

∆c1 = perubahan absorbansi campuran reaksi I sebelum dan

sesudah inkubasi ∆c2 = perubahan absorbansi campuran reaksi II sebelum dan

sesudah inkubasi

37) Lignin peroksidase (LiP) dengan veratril alkohol sebagai substrat. -

Buat campuran reaksi dengan volume total 5 ml terdiri atas: ƒ 2 mM veratril alkohol di dalam 100 mM natrium tartrate pH 3,5

ƒ 0,2 – 0,5 ml larutan enzim

ƒ 0,05 – 0,1 mM H 2 O 2

- Kocok perlahan campuran reaksi dengan vortex lalu diinkubasi selama 15 menit pada suhu ruang. -

Untuk larutan kontrol, didihkan campuran reaksi pada 60 º

C selama

5 menit.

- Ukur absorbansi campuran reaksi pada panjang gelombang 310 nm sebelum dan sesudah inkubasi. Satu unit aktivitas LiP didefinisikan dengan jumlah enzim yang diperlukan untuk oksidasi 1 µmol veratral alkohol menjadi veratraldehid per menit. Jumlah veratraldehid yang dihasilkan dihitung dengan rumus sbb:

∆c = (At - A0)/k . b Keterangan:

∆c = jumlah veratraldehid yang terbentuk selama t menit (mol L -1 ) A0 = nilai absorbansi pada awal reaksi

At = nilai absorbansi pada t menit

k = molar absorptivitas veratraldehid 9.300 M -1 cm

b = tebal larutan (1 cm)

6 ∆c X 10 3 X vol. larutan total X 10 Uni aktivitas LiP =

menit X vol. larutan enzim (ml)

38) Lakase dengan syringaldazina sebagai substrat (Bonnen et al ., 1994) -

Buat campuran reaksi dengan volume total 4 ml terdiri atas: ƒ 2,5 ml bufer McIlvaine (pH6,0)

ƒ 1 ml siringaldazina 0,075 mM ƒ 0,5 ml larutan enzim

- Kocok perlahan campuran reaksi dengan vortex lalu inkubasi

selama 15 menit pada suhu ruang. - Untuk kontrol, didihkan campuran reaksi pada 60 º

C selama 5 menit.

- Ukur absorbansi campuran reaksi pada panjang gelombang 525 nm sebelum dan sesudah inkubasi. Satu unit aktivitas lakase didefinisikan dengan jumlah enzim yang diperlukan untuk untuk mengoksidasi 1 µmol siringaldazina menjadi kuinon per menit. Jumlah kuinon yang dihasilkan dihitung dengan rumus sbb:

∆c = (At - A0)/ k . b Keterangan:

∆c = jumlah kuinon yang dibentuk selama t menit (µmol ml -1 ) A0 = nilai absorbansi pada awal reaksi

At = nilai absorbansi pada t menit k = molar absorptivitas kuinon = 65.000 M -1 cm -1

b = tebal larutan (1 cm)

6 ∆c X 10 3 X vol. larutan total X 10 Unit aktivitas lakase =

menit X vol. larutan enzim (ml)