Pirofosfatase Anorganik (Tabatabai, 1982)

4.4.5 Pirofosfatase Anorganik (Tabatabai, 1982)

Alat

- Tabung sentrifugasi plastik ukuran 50 ml - Inkubator atau penangas air dengan pengatur suhu - Shaker - Sentrifugasi - Spektrofotometer

Bahan

- NaOH, 1 N - Larutan stok modified universal buffer (MUB) (sama seperti di atas)

- Larutan pirofosfat 50 mM ƒ Larutkan 2,23 g natrium pirofosfat dekahidrat (Na 4 P 2 O 7 .10H 2 O) dalam 20 ml larutan stok MUB, sesuaikan pH larutan menjadi pH

8 dengan titrasi 0,1 HCl. Encerkan menjadi 100 ml dengan akuades. Pereaksi ini harus selalu dalam keadaan baru.

- MUB pH 8 ƒ Sesuaikan pH 200 ml MUB menjadi pH 8 dengan titrasi 0,1 N HCl, encerkan menjadi 1.000 ml dengan akuades.

- Asam sulfat (H 2 SO 4 ) 1N

ƒ Larutkan 250 ml H 2 SO 4 pekat dalam 8 L akuades, encerkan menjadi 9 L dengan akuades.

- Pereaksi asam askorbat (0,1 M)-asam trikloroasetat (0,5M) (pereaksi A) ƒ Larutkan 8,8 g asam askorbat dan 41 g asam trikloroasetat dalam 400 ml air, encerkan menjadi 500 ml dengan akuades.

Pereaksi ini harus selalu dalam keadaan baru. - Pereaksi ammonium molibdat tetrahidrat [(NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 .4H 2 O]

(0,015M) (pereaksi B) ƒ Larutkan 9,3 g ammonium molibdat dalam 450 ml akuades, encerkan menjadi 500 ml dengan akuades. - Pereaksi natrium sitrat (0,15 M)-natrium arsenit (0,3 M)-asam asetat

(7,5%) (pereaksi C):

ƒ Larutkan 44,1 g natrium sitrat dan 39 g natrium arsenit dalam 800 ml akuades, tambahkan asam asetat glasial (99,9%),

ditambah akuades sampai keseluruhan menjadi 1.000 ml.

- Larutan stok standar fosfat (PO 3 4 ─ −P)

ƒ Larutkan 0,439 g kalium dihidrogen fosfat (KH 2 PO 4 ) dalam 700 ml akuades, encerkan menjadi 1.000 ml dengan akuades.

Larutan ini mengandung 100 µg PO -1

- Masukkan 1 g contoh tanah (< 2mm) dalam tabung sentrifugasi plastik ukuran 50 ml, tambahkan 3 ml 50 mM larutan pirofosfat, kemudian kocok selama beberapa detik. Tutup rapat tabung sentrifugasi dan inkubasi pada suhu 37 o

C selama 5 jam. Setelah inkubasi, buka tabung sentrifugasi dan segera tambahkan 3 ml MUB pH 8 dan 25 ml 1 N H 2 SO 4 . Tutup tabung sentrifugasi, letakkan pada shaker, goyang secara horizontal selama 3 menit. Kemudian sentrifugasi selama 30 menit pada 12.000

rpm, segera perlakukan aliquot supernatan untuk analisis PO 3 4 ─ −P. - Analisis larutan Pi yang dilepas oleh aktivitas pirofosfatase anorganik:

ambil 1 ml aliquot cairan supernatant dengan pipet dan masukkan ke dalam gelas ukur 25 ml yang telah diisi 10 ml pereaksi A, segera tambahkan 2 ml pereaksi B dan 5 ml pereaksi C, dan tambah air sampai

25 ml dan kocok selama 15 menit. Ukur intensitas warna biru dengan spektofotometer pada panjang gelombang 700 nm.

- Di dalam menentukan kadar PO 3 ─

4 −P, buat grafik kalibrasi dari deret larutan standar yang terdiri atas 0, 5, 10, 15, 20, dan 25 µg PO 3 4 ─ −P.

Pipet dan masukkan sebanyak 0, 5, 10, 15, 20, dan 25 ml aliquot dari larutan stok PO 3 4 ─ −P dalam gelas ukur 100 ml, encerkan menjadi 100 ml dengan akuades. Selanjutnya Ukur intensitas warna biru dengan spektofotometer pada panjang gelombang 700 nm.

- Jika ternyata intensitas warna dari cairan contoh tanah melebihi intensitas warna dari larutan standar 50 µg PO 3 4 ─ −P, maka encerkan dengan menambahkan akuades sampai intensitas warna pada kisaran warna larutan standar.

- Setiap analisis satu contoh tanah, buat perlakuan blanko untuk faktor koreksi bagi intensitas warna yang berasal bukan dari pelepasan PO 3 4 ─ −P (dari pirofosfat) oleh aktivitas pirofosfatase. Masukkan 3 ml MUB ke tabung sentrifugasi plastik ukuran 50 ml, pH 8, inkubasi selama 5 jam. Setelah inkubasi, tambahkan 3 ml 50 mM pirofosfat, dan segera

tambahkan 25 ml 1 N H 2 SO 4 , lalu tutup tabung sentrifugasi dan letakkan pada shaker, goyang selama 3 menit. Kemudian sentrifugasi selama 30 menit pada 12.000 rpm. Segera perlakukan aliquot supernatan untuk

analisis PO 3 ─

4 −P. Ambil 1 ml aliquot cairan supernatant dengan pipet dan masukkan dalam gelas ukur 25 ml yang telah diisi 10 ml pereaksi A,

segera tambahkan 2 ml pereaksi B dan 5 ml pereaksi C, tambahkan air sampai 25 ml dan kocok selama 15 menit. Ukur intensitas warna biru segera tambahkan 2 ml pereaksi B dan 5 ml pereaksi C, tambahkan air sampai 25 ml dan kocok selama 15 menit. Ukur intensitas warna biru

Perhitungan

−P g -1 tanah) = µg kurva x fk x fp Keterangan :

Aktivitas pirofosfatase (µg PO 3 4 ─

µ g kurva = kadar PO 3 4 ─ −P contoh tanah yang didapat dari kurva hubungan antara kadar deret standar dengan pembacaannya setelah dikoreksi dengan blanko.

fk = faktor koreksi kadar air fp

= faktor pengenceran