Enumerasi Total Koliform dengan Metode MPN
2.13.2 Enumerasi Total Koliform dengan Metode MPN
(Raymundo et al., 1991)
Alat
- Tabung bertutup ulir - Tabung Durham - Cawan Petri - Pipet mikro (1 ml dan 200 µl) - Inkubator - Lup inokulasi - Blender - Botol pengencer
Bahan
- Lauryl sulfate tryptose broth (LSTB) dengan tabung Durham Larutkan 20 g triptosa ( casein digest pankcreatic ); 5,0 laktosa; 2,75 g K 2 HPO 4 ; 2,75 KH 2 PO 4 ; 5,0 g NaCl; 0,1 g CaCl 2 berurutan
dengan akuades 1.000 ml. Tuang media yang telah larut ke dalam tabung-tabung berulir yang mengandung tabung Durham masing-masing sebanyak 10 ml. Sterilisasi tabung-tabung berisi media pada suhu 121°C, tekanan 0,1 MPa, selama 15 menit.
- Brillliant green bile lactose broth (BGLB) dengan tabung Durham
Larutkan 10 g pepton; 10 g laktosa; 20 g Oxgall; 0,0133 g brilliant green dengan akuades 1.000 ml. Sesuaikan pH menjadi
pH 7,2. Tuang media yang telah larut ke dalam tabung-tabung berulir yang mengandung tabung Durham masing-masing sebanyak 10 ml. Sterilisasi tabung-tabung berisi media pada suhu 121°C, 0,1 MPa, selama 15 menit.
- Eosine methylene blue (EMB) agar cawan Larutkan 10 g pepton; 5 g laktosa; 5 g sukrosa; 2 g K 2 HPO 4 ; 0,4
g Eosin Y; dan 0,0065 g biru metilena dengan 1.000 ml akuades dalam Erlemeyer. Sesuaikan pH menjadi pH 7.2. Tambahkan 13,5 g agar. Sterilisasi media pada suhu 121°C, 0,1 MPa, selama 15 menit. Setelah hangat kuku (45°C) tuang ke cawan Petri steril.
- Agar miring nutrient agar (NA) Larutkan NA dalam akuades dengan jumlah sesuai takaran yang diberikan pabrik lalu rebus dalam penangas sampai agar larut.
NA yang telah larut dituang ke dalam tabung-tabung reaksi sebanyak 9 ml lalu tutup dan sterilisasi pada 121°, 0,1MPa, selama 15 menit. Setelah steril, media NA dimiringkan pada papan miring sampai beku.
- Reagen pewarnaan Gram Larutkan amonium oksalat kristal violet: Larutan A: larutkan 2 g kristal violet (90%) dalam 20 ml etanol
95% Larutan B: larutkan 0,8 g amonium oksalat dalam 80 ml akuades. Campurkan larutan A dan B
Larutan Gram’s Iodine (Ingol): Larutkan 1 g iodine (yodium) dan 2 g KJ dalam 300 ml akuades. Larutan safranin (counterstain): Encerkan 10 ml safranin O (2,5% dalam etanol 95%) dengan
100 ml akuades. - Biakan
E. coli sebagai kontrol - Larutan pengencer akuades steril Masukan akuades masing-masing 99 ml dan 9 ml ke botol-botol
pengencer. Sterilisasi tabung-tabung berisi larutan pengencer pada suhu 121°C, 0,1 MPa, selama 15 menit.
- Larutan pengencer garam fisiologis (NaCl 0,85%) Larutkan 8,5 g NaCl dengan 500 ml akuades lalu cukupkan akuades menjadi 1.000 ml. Masukkan 90 ml dan 9 ml larutan
garam fisiologi ke dalam botol-botol pengencer. Sterilisasi tabung-tabung berisi larutan pengencer pada suhu 121°C, 0,1 MPa, selama 15 menit.
Prosedur
23) Persiapan contoh pupuk kandang, kompos atau tanah - Kering oven (105°C) 5 g contoh (pupuk kandang, kompos, atau
tanah) selama 24 jam, lalu timbang. Ukur berat kering dikalkulasikan terhadap persentase berat basah untuk faktor koreksi.
- Masukan 11 g contoh (pupuk kandang atau kompos limbah feses) ke dalam 99 ml akuades steril, lalu diblender 40 detik. Selanjutnya, buat pengenceran sampai 10 -5 .
- Untuk contoh tanah, masukkan 10 g contoh tanah lembap ke dalam
90 ml garam fisiologis steril, lalu kocok dengan mesin penggoyang selama 30 menit atau kocok dengan tangan dengan menggoyang botol 50 kali. Selanjutnya buat pengenceran suspensi tanah sampai
10 -6 (kurang atau lebih tergantung jumlah perkiraan bakteri koli yang ada dalam tanah).
24) Uji penduga - Inokulasi lima set tiga tabung yang mengandung 10 ml LSTB,
masing-masing 1 set tiga tabung dengan 1 ml suspensi contoh dari pengenceran 10 -1 , tiga tabung LSTB lainnya dengan 1 ml dari pengenceran 10 -2 , dan tiga tabung berikutnya dengan 1 ml dari masing-masing 1 set tiga tabung dengan 1 ml suspensi contoh dari pengenceran 10 -1 , tiga tabung LSTB lainnya dengan 1 ml dari pengenceran 10 -2 , dan tiga tabung berikutnya dengan 1 ml dari
tabung Durham dalam biakan media LSTB. Inkubasi kembali apabila biakan LSTB tabung negatif (tidak terdeteksi adanya gelembung udara selama 24 jam).
- Amati pertumbuhan dan produksi gas. Uji praduga positif adanya
koliform dicirikan oleh pembentukan gas dalam tabung LSTB. - Catat semua tabung LSTB positif dan lihat tabel MPN untuk tiga tabung per pengenceran (Tabel Lampiran 1) dan hitung MPN
penduga bakteri koliform per g (berat kering sampel).
25) Uji penguat - Transfer 1 lup suspensi biakan dari masing-masing tabung LSTB
positif ke satu tabung BGLBB 2%. Inkubasi tabung pada 37°C selama 48 jam.
- Amati adanya pertumbuhan (kekeruhan) dan pembentukan gas pada tabung BGLBB untuk menegaskan adanya koliform.
- Terbentuknya gas di dalam LSTB atau di dalam BGLBB tidak selalu menunjukkan jumlah bakteri koli karena mikroba lainnya mungkin juga ada yang dapat memfermentasi laktosa dengan membentuk gas, misalnya bakteri asam laktat dan khamir tertentu. Oleh karena itu perlu dilakukan uji penguat pada media agar cawan EMB (Fardiaz, 1989). Inokulasi 1 lup biakan dari tabung BGLBB pada media agar cawan dengan cara gores kuadran lalu inkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam.
- Tentukan MPN koliform dalam contoh berdasarkan jumlah tabung
BGLBB yang menunjukkan adanya pembentukan gas pada 37°C selama 48 jam dan pertumbuhan koloni pada media agar cawan EMB.
- Hitung MPN penguat koliform per g (berat kering sampel).
26) Uji lengkap - Gores satu koloni tipikal (bagian tengah koloni gelap dengan
kilauan hijau metalik untuk
E. coli atau koloni kecoklatan konvek, mukoid untuk Enterobacter dan organisme koliform lain) dari EMB ke media agar miring NA dan inokulasi ke media LSTB. Inkubasi agar miring selama 24 jam dan tabung LSTB selama 48 jam pada suhu 37°C.
- Uji lengkap dilakukan untuk melihat apakah isolat yang diambil benar merupakan bakteri koliform.
- Buat pewarnaan Gram terhadap biakan dalam media agar miring
NA dan amati adanya pembentukan gas pada media LSTB. Adanya gas dalam tabung LSTB dan penampakan bakteri Gram negatif, yang tidak membentuk spora merupakan uji lengkap adanya koliform.
Rumus perhitungan
Nilai MPN X FP Jumlah populasi /(g bk) = b.k. contoh
Dimana b.k. contoh = berat basah contoh x (1 - kadar air) (Lihat cara penetepan kadar air pada 2.2.2) FP (faktor pengenceran) = 1/pengenceran tabung yang di tengah
bk = berat kering contoh
Cara perhitungan
- Setiap hasil pengenceran contoh diinokulasikan masing-masing 1 ml ke dalam 3 tabung LSTB atau BGLBB (MPN dengan tiga tabung). Setelah inkubasi, dilihat tabung yang positif. Kombinasi yang dipilih dimulai dari pengenceran tertinggi yang masih menghasilkan semua tabung positif, sedangkan pada pengenceran berikutnya ada tabung yang negatif. Kombinasi yang dipilih terdiri atas tiga pengenceran.
- Misalnya pada pengenceran 10 -3 , ketiga tabung menghasilkan pertumbuhan positif, pada pengenceran 10 -4 dua tabung positif, pada
pengenceran 10 -6 satu tabung positif, dan pada pengenceran 10 tidak ada tabung yang positif. Kombinasi tabung positif menjadi 3, 2, 1, 0, dan
jika diambil tiga pengenceran yang pertama kombinasinya adalah 3, 2,
1. Setelah dicocokan dengan tabel nilai MPN (lihat lampiran tabel MPN), hasilnya adalah sebagai berikut:
Kombinasi = 3 – 2 – 1 Nilai MPN dari tabel MPN untuk tiga tabung = 1,5, maka populasi koliform adalah:
1,5 x 10 5
Jumlah populasi /(g bk) =
b.k. contoh