Karakterisasi Kekerabatan dengan Analisis Genom DNA

2.4.3 Karakterisasi Kekerabatan dengan Analisis Genom DNA

Alat

- Pipet mikro - Tip mikro 1 ml dan 200 µl. - Pulsed field gel electrophoresis (PFGE)

Bahan

- Larutan PIV (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 M NaCl) - 1,5%LMA - Larutan penyangga Tris EDTA (TE) (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM

EDTA, pH 8,0). - Larutan EC-lysis (6 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM EDTA, pH 7,5; 1 M NaCl; 0,5% polioksietilen-2-cetil-eter; 0,2% natrium deoksikolat; 0,5% natrium lauril sarkosin; 1 mg ml -1 lisozim)

- Larutan EC-lysis dengan larutan EDTA natrium lauril sarkosin proteinase-K (ESP) (0,5 M EDTA, pH 9,0 - 9,5; 1% natrium lauril sarkosin; 200 -1 µg ml proteinase-K),

- Larutan penyangga TE - Larutan perendaman (1,5 µl bovine serum albumin 100x; 15 µl

larutan penyangga enzim restriksi 10x; 133,5 µl ddH 2 O) - Agarosa (HMA 1%) - Larutan penyangga 0,5 x tris borat EDTA (TBE) (45 mM trisma

basa; 45 mM -H 3 BO 3 ; 1,25 mM EDTA (pH 8,0)

Prosedur

1) Preparasi DNA genom in situ - Tumbuhkan isolat uji pada medium dan suhu pertumbuhan

optimumnya hingga populasi selnya mencapai 10 9 sel/ml. - Sentrifus 1 ml suspensi bakteri dengan kecepatan 11.000 rpm

selama 1 menit. Cuci pelet sel dengan 0,5 ml larutan PIV (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 M NaCl) lalu sentrifus. Larutkan kembali pelet dengan 0,45 ml larutan PIV lalu tambah 0,9 ml LMA 1,5 % di dalam larutan penyangga Tris EDTA (TE) (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA, pH 8,0).

- Cetak campuran ini segera pada cetakan plug dan biarkan memadat. Rendam sisipan gel berisi sel (gel insert atau gel plug ) yang diperoleh dalam larutan EC-lysis (6 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 - Cetak campuran ini segera pada cetakan plug dan biarkan memadat. Rendam sisipan gel berisi sel (gel insert atau gel plug ) yang diperoleh dalam larutan EC-lysis (6 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100

water bath 37 o

C selama 6 jam.

- Ganti larutan EC-lysis dengan larutan EDTA natrium lauril sarkosin

proteinase-K (ESP) (0,5 M EDTA, pH 9,0 - 9,5; 1% natrium lauril sarkosin; 200

µg ml -1 proteinase-K), lalu digoyang dengan kecepatan 50 - 60 rpm pada suhu 55 o

C selama 48 jam. - Setelah itu lakukan pencucian sisipan gel dengan larutan

penyangga TE pada suhu 37 o

C selama 30 menit dan diulangi lima kali masing-masing selama 2 jam. Sisipan gel tersebut dapat

disimpan pada suhu 4 o

C di dalam larutan penyangga TE sampai digunakan.

2) Pemotongan DNA genom - Apabila strain mikroba uji memiliki persentase mol Guanin dan Sitosin (G+C) di atas 50%, misalnya 59-64% untuk genus Rhizobium dan 61-65% untuk genus Bradyrhizobium , maka pilih enzim restriksi yang memiliki titik potong pada pasangan basa yang

kaya Adenin atau Timin. Penggunaan enzim restriksi yang memotong jarang akan menghasilkan sejumlah kecil fragmen besar yang dapat dipisahkan dengan PFGE. Menurut McClelland et al . (1987), Spe

I yang memiliki situs pengenalan 5’-A/CTAGT-3’ mengandung tetranukleotida CTAG yang akan memotong jarang DNA genom bakteri dengan persentase mol Guanin dan Sitosin tinggi.

- Potong DNA genom dengan mengiris sisipan gel selebar 2 mm lalu

rendam potongan sisipan gel dalam 150 µl larutan perendaman (1,5 µl bovine serum albumin 100x; 15 µl larutan penyangga enzim

restriksi 10x; 133,5 µl akuabides). - Inkubasi campuran selama 15 menit di dalam es. Selanjutnya,

ganti larutan perendam sisipan gel dengan 150 µl larutan perendaman yang baru dan tambah 1 µl enzim restriksi sambil

diresuspensikan. - Inkubasi campuran selama 15 menit di dalam es, dilanjutkan

C selama 4 jam di dalam shaking water bath (Suwanto & Kaplan, 1989). - Lakukan dialisis selama 10 – 15 menit dalam larutan penyangga

dengan inkubasi pada suhu 37 o

satu kali TE. Sisipan gel tersebut dapat disimpan pada suhu 4 o C hingga siap dilarikan pada elektroforesis dengan cara direndam di

dalam larutan penyangga satu kali TE.

3) Pemisahan fragmen-fragmen DNA dengan PFGE (elektroforesis) - Masukkan potongan sisipan gel ke dalam sumur pada matriks

agarosa (HMA 1%). Pada permukaan sumur yang telah diisi sisipan gel ditutup dengan 1,5% LMA dan dibiarkan selama 10 menit di dalam lemari pendingin. Setelah memadat, matriks agarosa agarosa (HMA 1%). Pada permukaan sumur yang telah diisi sisipan gel ditutup dengan 1,5% LMA dan dibiarkan selama 10 menit di dalam lemari pendingin. Setelah memadat, matriks agarosa

45 mM H 3 BO 3 ; 1,25 mM EDTA pH 8,0) dilakukan dengan kondisi waktu pulsa ramping 5 - 60 detik, 20 jam, 5,4 Volt, 14 o C.

4) Visualisasi DNA -

Rendam matriks agarosa yang telah diangkat dari alat PFGE dalam larutan etidium bromida (1

µg ml -1 ) selama 10 menit lalu bilas dengan akuades selama 20-30 menit.

- Amati pola pita DNA di atas UV-transilluminator pada λ: 280 nm dan dokumentasi dengan kamera polaroid berfilter jingga.