Pertanaman Spora Tunggal

2.7.4 Pertanaman Spora Tunggal

Prinsip

Cendawan MA tidak dapat ditumbuhkan pada media buatan karena cendawan ini merupakan simbion obligat, sehingga untuk perkembangannya cendawan ini harus bersimbiosis dengan suatu tanaman. Spora-spora yang dikumpulkan dari lapang dapat terdiri atas berbagai spesies. Upaya pemurnian harus dilakukan dengan menginokulasikan satu spora dengan tanaman inang tertentu, dengan tujuan untuk mendapatkan satu isolat yang kemungkinan merupakan satu spesies tertentu.

Bahan

- Zeolit - Arang sekam

- Fosfat alam (sebagai sumber P) dan larutan Yoshida (tanpa hara P) - Contoh tanah dan pot plastik untuk tanaman pancingan (trapping)

Gelas plastik (sebagai wadah campuran zeolit dan arang sekam) untuk pertanaman spora tunggal - Benih jagung - Gula pasir - Kertas saring

- Chloramine T - HgCl 2

Alat

- Beker gelas (sebagai wadah mencampur zeolit dan arang sekam) - Saringan metal berukuran 38, 53, 100, dan 500 µ - Blender - Sentrifus

Prosedur

4) Pertanaman pancingan - Tempatkan ± 2 kg contoh tanah dalam pot (kalau contoh tanah ini

kurang, tambahkan tanah pengencer yang sudah steril, agar volume tanah ini memadai untuk lama pertanaman pancingan 2-3 bulan).

- Airi hingga kapasitas lapang. - Beri pupuk fosfat alam, dan larutan Yoshida (lihat halaman 77) tanpa hara P secukupnya untuk tanaman jagung. - Tanam empat benih jagung dan setelah 10 hari jarangkan menjadi dua tanaman. -

Siram tanaman sesuai dengan kebutuhan. -

Panen tanaman setelah berumur 2-3 bulan dengan jalan memotong tanaman pada pangkal batang.

5) Isolasi spora

- 50 g contoh tanah ditambah 300 ml air, lalu diblender tiga kali, masing-masing 1 menit.

- Saring suspensi yang diperoleh dengan saringan bertingkat yang disusun bertingkat mulai dari ukuran yang terbesar paling atas dan terkecil paling bawah Hasil saringan teratas biasanya berupa serasah dan potongan akar tanaman. Satukan hasil dari tiga saringan lain dalam satu beker gelas. Bagi-bagikan suspensi ini ke dalam tabung-tabung sentrifus.

- Timbang tiap tabung agar seimbang sebelum dimasukkan ke dalam sentrifus.

- Sentrifugasi tabung-tabung ini dengan kecepatan 1.500 putaran per menit (rpm) selama 90 detik.

- Buang supernatannya, tambahkan larutan gula 48%, dan aduk, sehinga endapan yang ada terlarut.

- Setimbangkan semua tabung, lalu sentrifugasi dengan kecepatan 1.000 ppm selama 1 menit.

- Tuangkan supernatannya ke dalam saringan metal ukuran 38 µ dan semprot saringan dari belakang dan tampung spora yang disemprot dalam cawan Petri.

- Pilih spora yang masih segar dan utuh dengan bentuk dan warna

yang berbeda dan berukuran 38-450 µ, dengan asumsi bahwa spora ini dari takson yang berbeda.

6) Inokulasi spora tunggal -

Kecambahkan benih jagung steril (disterilisasi dengan larutan HgCl 2 selama 10 menit) di atas kertas saring basah yang banyaknya cukup untuk spora-spora terpilih di atas. Gunakan kecambah yang berumur 3-4 hari.

- Sterilkan tiap spora terpilih dengan menempatkannya di atas kertas

saring yang sangat jenuh dengan larutan Chloramine T 2% selama

20 menit. - Letakkan tiap-tiap spora dengan menggunakan jarum/pinset steril

pada potongan kecil kertas saring steril berukuran 1x 1 cm, lalu tempelkan pada akar kecambah jagung (lihat Gambar 4).

- Tanam kecambah dalam media campuran zeolit dan arang sekam dengan perbandingan 3:1 (b/b) dalam gelas plastik. Tempatkan gelas-gelas plastik dalam ruang tumbuh (lihat Gambar 5).

- Pupuk dengan larutan Yoshida (lihat halaman 77) tapi tanpa hara P dan sebagai gantinya gunakan fosfat alam. Berikan larutan hara 10 ml pada minggu pertama; 20 ml tiap kali pada minggu 2-3, sekali tiap minggu; 20 ml tiap kali pada minggu keempat dan selanjutnya, dua kali semingu. Sesuaikan dengan pertumbuhan tanaman.

- Siram tanaman dengan air steril sampai kapasitas lapang. Airi sesuai dengan kebutuhan tanaman.

- Panen tanaman setelah berumur kira-kira 2 bulan. Cek kolonisasi mikoriza pada akar sebelum dipanen sesuai dengan prosedur pada

2.7.2. Tanaman dikatakan terkolonisasi oleh cendawan MA, apabila pada jaringan akar terdapat struktur hifa, arbuskel, dan/atau vesikel.

- Lakukan isolasi spora untuk identifikasi sesuai dengan prosedur isolasi spora di atas.

- Bahan spora siap diamati di bawah mikroskop dan diidentifikasi.

Gambar 4. Cawan Petri dengan kertas saring berisi spora tunggal (gambar kiri) dan penempelan spora pada akar kecambah jagung (Foto: Rohani C.B. Ginting)

Gambar 5.Tanaman jagung yang diinokulasi spora tunggal di ruang tumbuh