Koleksi dan Isolasi Bradyrhizobium
2.4.1 Koleksi dan Isolasi Bradyrhizobium
Alat
- Cawan Petri - Oven - Tabung reaksi - Neraca analitik ketelitian tiga desimal - Beker gelas - Labu Erlenmeyer - Penangas air - Pengocok magnet - Pipet mikro - Tip 1 ml dan 200 µl.
Bahan
- Media seleksi Bradyrhizobium sari khamir manitol (SKM) agar Larutkan 0,5 g K 2 HPO 4 ; 0,2 g M g SO 4 .7H 2 O; 0,1 g N a Cl; 10 g Manitol; 0,5 g sari khamir; 15 g agar bakto; dan 10 ml merah
kongo atau bromtimol biru (0,25%) dalam akuades 1.000 ml.
Prosedur
Koleksi bintil akar dilakukan dengan cara mencabut akar tanaman secara hati-hati. Buat lingkaran pada tanaman dengan radius 15 cm dengan menggunakan sendok tanah. Lalu cabut tanaman dengan memasukkan sendok tanah dengan kedalaman 20 cm. Perlahan-lahan angkat akar tanaman, bersihkan tanah dari akar dengan tangan. Lalu pindahkan bintil akar ke dalam plastik, dan simpan dalam kotak es sebelum diisolasi.
Di laboratorium, bintil akar ditaruh di atas saringan lalu dicuci dengan cara mengalirinya dengan air. Bintil akar segar dapat disimpan dalam lemari es semalam. Untuk penyimpanan yang lama, disarankan disimpan
dalam tabung gelas kering. Bintil akar yang aktif menambat N 2 mengandung protein yang disebut leghaemoglobin, berwarna merah muda-merah, atau kecoklatan. Bintil akar yang tidak efektif kurang leghaemoglobin, berwarna putih.
6) Isolasi Bradyrhizobium . - Untuk isolasi dari bintil akar, ambil 10 bintil akar, taruh dalam
Erlenmeyer 125 ml, cuci permukaan bintil akar dengan 95% etanol selama 1 menit, lalu pindahkan ke dalam cawan Petri steril dan sterilisasi dengan kalsium hipokhlorit atau hidrogen peroksida
(H 2 O 2 ) 3% dan kocok selama 4-6 menit. Kemudian bilas lima kali dengan air steril. Tetesi bintil akar yang telah dikeringkan dengan air steril, lalu hancurkan dengan menggunakan batang gelas dalam tabung reaksi. Ambil dengan ose suspensi bintil lalu goreskan ke medium seleksi sari khamir manitol (SKM) agar yang mengandung merah kongo atau bromtimol biru.
- Untuk isolasi dari tanah, suspensikan 10 g contoh dalam 90 ml larutan garam fisiologis steril. Lakukan pengenceran seri dengan
menggunakan 9 ml garam fisiologis steril hingga 10 5 . Inokulasikan suspensi tanah ke dalam medium seleksi SKM agar yang dibubuhi
merah kongo atau bromtimol biru. - Isolat tersebut diinkubasi hingga 10 hari. Amati pertumbuhannya, lalu hitung populasinya berdasarkan metode MPN. Koloni Bradyrhizobium biasanya disertai pembentukan lendir polisakharida ekstraseluler dalam jumlah yang cukup banyak.
7) Penentuan populasi Bradyrhizobium tanah dengan metode MPN. -
Siapkan tanaman siratro. - Toreh benih siratro dengan dengan pisau silet, lalu sterilisasi permukaan dengan alkohol 95% selama 1 menit dan H 2 O 2 3% selama 5 menit, cuci dengan akuades steril enam kali. - Kecambahkan benih siratro pada kertas saring lembap steril dalam cawan Petri pada kondisi gelap selama 2 hari. - Tanam kecambah siratro pada media agar setengah padat yang ditambah larutan hara Ahmad & Evans tanpa N (Somasegaran & Hoben, 1994).
8) Pengenceran contoh tanah - Suspensikan 10 g contoh dalam 90 ml larutan garam fisiologis
steril, lakukan seri pengenceran dengan menggunakan 9 ml garam fisiologis steril hingga 10 -9 .
9) Inokulasi suspensi tanah ke kecambah siratro
- Inokulasi sekitar perakaran kecambah siratro dengan 1 ml suspensi tanah dari setiap pengenceran. Setiap pengenceran diinokulasikan pada tiga atau lima tabung kecambah siratro.
- Inkubasi tabung-tabung kecambah siratro yang telah diinokulasi dalam growth chamber sampai perakaran siratro membentuk bintil akar (kira-kira dua minggu).
- Catat tabung-tabung yang menunjukkan pembentukan bintil akar pada perakaran siratro (tabung positif).
Perhitungan
mxd
Populasi Rhizobium (g bk) =
bk = berat kering tanah m = massa sel (jumlah sel)
d = pengenceran
V = volume suspensi yang diinokulasi