Fosfomonoesterase (Tabatabai & Bremner, 1969; Eivazi & Tabatabai, 1977)

4.4.2.1 Fosfomonoesterase (Tabatabai & Bremner, 1969; Eivazi & Tabatabai, 1977)

Alat

- Labu Erlenmeyer berpenutup ukuran 50 ml. - Inkubator atau penangas air dengan pengatur suhu. - Spektrofotometer

Bahan

- Toluena, senyawa kimia bersertifikasi Fisher (Fisher Scientific Co., Chicago) - Larutan stok modified universal buffer (MUB).

ƒ Larutkan 12,1 g tris(hidroksimetil) aminometan (THAM), 11,6 g asam maleat, 14 g asam sitrat, dan 6,3 g asam borat (H 3 BO 3 )

dalam 488 ml 1M NaOH. Encerkan menjadi 1.000 ml dengan akuades. Simpan pereaksi dalam alat pendingin (refrigerator).

- Larutan modified universal buffer (MUB) pH 6,5 dan 11. ƒ Masukkan 200 ml MUB dalam gelas beker ukuran 500 ml yang telah diberi magnet pengaduk dan letakkan gelas beker tersebut

di atas stirrer bermagnet. Sesuaikan pH MUB menjadi pH 6,5 dengan titrasi 0,1 M HCl dan encerkan menjadi 1.000 ml dengan akuades.

ƒ Masukkan 200 ml MUB dalam gelas beker ukuran 500 ml yang telah diberi magnet pengaduk dan letakkan gelas beker tersebut

di atas stirrer bermagnet. Sesuaikan pH MUB menjadi pH 11 dengan titrasi 0,1 M NaOH dan encerkan menjadi 1.000 ml dengan akuades.

- Larutan p -nitrofenil fosfat (PNP) 0,025 M ƒ Larutkan 0,42 g dinatrium p -nitrofenil fosfat tetrahidrat (Sigma 104, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) dalam 40 ml MUB pH

6,5 (untuk penetapan fosfatase asam) atau pH 11 (untuk penetapan fosfatase basa) dan encerkan dengan 50 ml MUB yang mempunyai pH yang sama. Simpan pereaksi ini dalam alat pendingin (refrigerator).

- Kalsium klorida (CaCl 2 ) 0,5 M

ƒ Larutkan 73,5 g CaCl 2 .H 2 O dalam 700 ml akuades dan encerkan menjadi 1.000 ml dengan akuades.

- Natrium hidroksida (NaOH) 0,5 M ƒ Larutkan 20 g NaOH dalam 700 ml akuades dan encerkan menjadi 1.000 ml dengan akuades. - Larutan stok standar p -nitrofenol ƒ Larutkan 1 g p -nitrofenol dalam 70 ml akuades dan encerkan menjadi 1.000 ml dengan akuades. Simpan pereaksi dalam alat

pendingin (refrigerator).

Prosedur

- Masukkan 1 g contoh tanah (< 2mm) ke dalam labu Erlenmeyer ukuran

50 ml. - Tambahkan 0,2 ml toluena, 4 ml MUB (pH 6,5 untuk penetapan fosfatase

asam dan pH 11 untuk penetapan fosfatase basa), 1 ml larutan p -nitrofenil fosfat pada MUB yang sama kemudian kocok selama beberapa detik.

- Tutup rapat labu Erlenmeyer dan inkubasi pada suhu 37 o

C selama 1 jam. - Setelah inkubasi, tambahkan 1 ml 0,5 M CaCl 2 dan 4 ml 0,5 M NaOH,

kemudian kocok selama beberapa detik. - Saring larutan tanah dengan kertas saring Whatman No. 2v dimana filtrat

hasil penyaringan berwarna kuning. Ukur intensitas warnanya dengan spektofotometer pada panjang gelombang 420 nm.

- Di dalam menentukan kadar p -nitrofenol, buat grafik kalibrasi dari deret larutan standar p -nitrofenol. Encerkan 1 ml larutan standar p -nitrofenol menjadi 100 ml dengan akuades dalam gelas ukur 100 ml. Masukkan 0,

1, 2, 3, 4, dan 5 ml aliquot larutan standar p -nitrofenol yang sudah diencerkan ke dalam labu Erlenmeyer ukuran 50 ml, tambahkan akuades sehingga menjadi 5 ml. Kemudian tambahkan 1 ml 0,5 M CaCl 2 dan 4 ml 0,5 M NaOH, kocok selama beberapa detik. Saring suspensi yang dihasilkan dengan kertas saring Whatman No.2v. Selanjutnya ukur intensitas warna kuning dengan spektofotometer pada panjang gelombang 420 nm.

- Jika ternyata intensitas warna dari filtrat contoh tanah yang diukur melebihi intensitas warna dari larutan standar 50 µg p -nitrofenol, maka encerkan filtrat dengan menambahkan akuades sampai intensitas warna pada kisaran warna larutan standar.

- Setiap analisis contoh tanah, buat perlakuan blanko untuk faktor koreksi bagi intensitas warna yang berasal bukan dari pelepasan p -nitrofenol akibat aktivitas fosfatase. Masukkan 0,2 ml toluena dalam labu Erlenmeyer ukuran 50 ml. Tambahkan 4 ml MUB (pH 6,5 untuk penetapan fosfatase asam dan pH 11 untuk penetapan fosfatase basa), 1 ml larutan p -nitrofenil fosfat pada MUB yang sama kemudian kocok selama beberapa menit. Tutup rapat labu Erlenmeyer dan inkubasi

selama 1 jam. Setelah inkubasi, tambahkan 1 ml 0,5 M CaCl 2 dan 4 ml 0,5 M NaOH, 1 ml larutan PNP kemudian kocok selama beberapa menit. Saring larutan tanah dengan kertas saring Whatman no. 2v. Filtrat hasil penyaringan berwarna kuning, ukur intensitas warnanya dengan spektofotometer pada panjang gelombang 420 nm. Hasil pengukuran merupakan faktor koreksi.

Perhitungan

Aktivitas fosfomonoesterase (µg -1 p -nitrofenol g tanah) = µg kurva x fk x fp Keterangan :

µ g kurva = kadar p -nitrofenol contoh tanah yang didapat dari kurva hubungan antara kadar deret standar dengan pembacaannya setelah dikoreksi dengan blanko.

fk = faktor koreksi kadar air [100%/ (100 – kadar air)%],

perhitungan kadar air seperti pada sub bab 2.2.

fp = faktor pengenceran