16 pemurnian. Proses pemurniaan diawali dengan penambahan Tris-Phenol :
Kloroform : Isoamilalkohol 25:24:1 dengan volume yang sama dan dibolak- balik hingga homogen. Larutan disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm pada
suhu 4 C selama 15 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung 1,5 ml yang baru
dan dimurnikan dengan larutan kloroform: isoamilalkohol 24:1 dengan volume yang sama dan dibolak-balik secara teratur, disentrifus dengan kecepatan 10.000
rpm pada suhu 4 C selama 15 menit. Supernatan diambil dengan pipet dan
dipindahkan ke tabung 1,5 ml yang baru dan steril. DNA diendapkan dengan penambahan 110 kali volume sodium asetat pH
5,2 dan 2 kali volume etanol absolut dingin, larutan dibolak-balik beberapa kali sampai DNA terlihat seperti benang-benang putih. DNA diinkubasi pada suhu -
20 C selama 3 jam dan disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4
C selama 15 menit. Supernatan dibuang dan pelet dibersihkan dengan 50 µl alkohol
70 dan disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 C selama 15
menit. DNA dikering-anginkan atau divakum pada suhu 37 C selama 10 menit.
DNA yang telah kering dilarutkan dengan aquabides ddH
2
O steril sebanyak 100 µl.
Kontaminan RNA pada DNA dihilangkan dengan cara menambahkan 5 µl RNAse 20 mgml dan diinkubasi selama 90 menit suhu 37
C. RNAse dinonaktifkan dengan cara diinkubasi pada suhu 70
C selama 3 menit dan selanjutnya disimpan pada suhu -20
C.
3.4.8. Uji Kualitas dan Kuantitas DNA
Kualitas sampel DNA ditentukan menggunakan teknik elektroforesis 0,8 gel agarose. Gel agarose 0,8 dibuat dengan melarutkan 0,8 gram agarose
dalam 100 ml buffer TAE 1 x Tris base, asam asetat glacial, 0,5 M EDTA, pH 8.0 dipanaskan hingga mendidih. Larutan agarose dituang ke dalam cetakan
elektroforesis yang di dalamnya telah diletakkan sisir sebagai cetakan sumur, dibiarkan sampai gel memadat. Gel diletakkan ke dalam bak elektroforesis yang
tela diisi larutan TAE 1 x sampai terendam. Sampel DNA dimasukkan ke dalam sumur gel dan dirunning secara elektrik selama 30 menit pada voltase 90 V.
Selanjutnya dilakukan dokumentasi gel dengan alat kodak gel logic UVITec,
Universitas Sumatera Utara
17 Cambridge
dengan software.
Kuantitas DNA
diukur menggunakan
nanophotometer Implen, Singapura.
3.4.9. Analisis Random Amplified Polymorfic DNA RAPD
Analisis RAPD
menggunakan 2
primer yaitu
W-15 5’-
ACAACCGGAAC - 3’ dan OPC-08 OPC-08 5’-TGGACCGGTG-3’ Hetharie,
2010 untuk melihat perubahan genetik dari induk terhadap hasil kultur jaringan. Reaksi PCR menggunakan Kit 2 x PCR Master Mix Solution iNtRON
Biotechnology, Korea Tabel 3.1. Bahan-bahan reaksi PCR tersebut dikondisikan pada suhu 94
C selama 2 menit untuk proses pre-denaturasi. Amplifikasi dilakukan sebanyak 40 siklus dengan tahapan sebagai berikut: 94
C selama 20 detik untuk denaturasi, 36
C selama 20 detik untuk penempelan primer, 72
C selama 1 menit untuk proses pemanjangan. Reaksi diakhiri pada suhu 72 C
selama 5 menit kemudian dikondisikan pada suhu tetap 4 C. Hasil PCR
dielektroforesis pada 1,2 gel agarose, tegangan listrik 70 volt, arus 100 ampere selama 90 menit. Gel agarose direndam dalam larutan pewarna ethidium bromide.
Hasil elektroforesis divisualisasikan dengan UV Transilluminator UVITec, Cambridge.
Tabel 3.1. Bahan-bahan untuk Satu Kali Reaksi PCR
No. Komponen PCR
Volume 1.
PCR reaction 10 µl
2. DNA 5 ngµl
2 µl 3.
Primer 10 pmolµl 1 µl
4. ddH
2
O 7 µl
Volume Akhir 20 µl
3.4.10. Variabel Pengamatan
