Induksi Kalus Pemeliharaan Kultur Subkultur Isolasi DNA

15

3.4.4. Induksi Kalus

Sebelum melakukan penanaman diupayakan agar ruangan dalam keadaan bersih. Penanaman eksplan dilakukan di dalam laminar air flow. Alat-alat diseksi, lampu bunsen dan alkohol 70 dipersiapkan terlebih dahulu. Eksplan yang akan ditanam dipotong hingga ukuran eksplan ±1cm selanjutnya ditanam dalam media kultur. Setiap botol kultur berisi satu eksplan. Penanaman dilakukan dengan cara aseptik sehingga setiap kali menggunakan pisau dan pinset terlebih dahulu dicelupkan kedalam alkohol 70 kemudian dibakar diatas lampu bunsen. Botol yang berisi eksplan ditutup dengan aluminium foil dan plastik, diikat dengan karet gelang dan disusun di rak kultur.

3.4.5. Pemeliharaan Kultur

Botol-botol yang berisi eksplan disusun dengan acak pada rak kultur sesuai dengan lay out penelitian. Ruang pemeliharaan kultur harus senantiasa dalam keadaan bersih dan aseptik dengan cara disemprot dengan alkohol 70 setiap hari. Suhu dijaga berkisar 22 o C dengan pengaturan AC. Botol kultur diletakkan diruang tanpa cahaya.

3.4.6. Subkultur

Sub kultur dilakukan dengan cara memindahkan kalus ke dalam media yang sama secara aseptik. Subkultur dilakukan pada interval empat minggu.

3.4.7. Isolasi DNA

Isolasi DNA berdasarkan metode CTAB Doyle Doyle, 1990 yang dimodifikasi. Sampel dari kalus sebanyak 0,4 g digerus dalam lumpang porselin dengan bantuan nitrogen cair. Sampel yang telah halus seperti tepung berwarna putih dimasukkan ke dalam tabung 1,5 ml yang telah berisi 1 ml buffer ektraksi 100 mM Tris HCl, 4 M NaCl, 20 mM ED TA, 3 CTAB, 6 PVP dan 0,2 β- mekaptoetanol yang telah dipanaskan pada suhu 65 C. Larutan dibolak-balik sampai terbentuk suspensi. Selanjutnya diinkubasi di dalam waterbath pada suhu 65 C selama 30 menit dan setiap 10 menit dibolak-balik. Setelah proses ekstraksi, sampel dibiarkan dingin pada suhu ruang dan dilanjutkan dengan proses Universitas Sumatera Utara 16 pemurnian. Proses pemurniaan diawali dengan penambahan Tris-Phenol : Kloroform : Isoamilalkohol 25:24:1 dengan volume yang sama dan dibolak- balik hingga homogen. Larutan disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 C selama 15 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung 1,5 ml yang baru dan dimurnikan dengan larutan kloroform: isoamilalkohol 24:1 dengan volume yang sama dan dibolak-balik secara teratur, disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 C selama 15 menit. Supernatan diambil dengan pipet dan dipindahkan ke tabung 1,5 ml yang baru dan steril. DNA diendapkan dengan penambahan 110 kali volume sodium asetat pH 5,2 dan 2 kali volume etanol absolut dingin, larutan dibolak-balik beberapa kali sampai DNA terlihat seperti benang-benang putih. DNA diinkubasi pada suhu - 20 C selama 3 jam dan disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 C selama 15 menit. Supernatan dibuang dan pelet dibersihkan dengan 50 µl alkohol 70 dan disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 C selama 15 menit. DNA dikering-anginkan atau divakum pada suhu 37 C selama 10 menit. DNA yang telah kering dilarutkan dengan aquabides ddH 2 O steril sebanyak 100 µl. Kontaminan RNA pada DNA dihilangkan dengan cara menambahkan 5 µl RNAse 20 mgml dan diinkubasi selama 90 menit suhu 37 C. RNAse dinonaktifkan dengan cara diinkubasi pada suhu 70 C selama 3 menit dan selanjutnya disimpan pada suhu -20 C.

3.4.8. Uji Kualitas dan Kuantitas DNA