15
3.4.4. Induksi Kalus
Sebelum melakukan penanaman diupayakan agar ruangan dalam keadaan bersih. Penanaman eksplan dilakukan di dalam laminar air flow. Alat-alat diseksi,
lampu bunsen dan alkohol 70 dipersiapkan terlebih dahulu. Eksplan yang akan ditanam dipotong hingga ukuran eksplan ±1cm selanjutnya ditanam dalam media
kultur. Setiap botol kultur berisi satu eksplan. Penanaman dilakukan dengan cara aseptik sehingga setiap kali menggunakan pisau dan pinset terlebih dahulu
dicelupkan kedalam alkohol 70 kemudian dibakar diatas lampu bunsen. Botol yang berisi eksplan ditutup dengan aluminium foil dan plastik, diikat dengan karet
gelang dan disusun di rak kultur.
3.4.5. Pemeliharaan Kultur
Botol-botol yang berisi eksplan disusun dengan acak pada rak kultur sesuai dengan lay out penelitian. Ruang pemeliharaan kultur harus senantiasa
dalam keadaan bersih dan aseptik dengan cara disemprot dengan alkohol 70 setiap hari. Suhu dijaga berkisar 22
o
C dengan pengaturan AC. Botol kultur diletakkan diruang tanpa cahaya.
3.4.6. Subkultur
Sub kultur dilakukan dengan cara memindahkan kalus ke dalam media yang sama secara aseptik. Subkultur dilakukan pada interval empat minggu.
3.4.7. Isolasi DNA
Isolasi DNA berdasarkan metode CTAB Doyle Doyle, 1990 yang dimodifikasi. Sampel dari kalus sebanyak 0,4 g digerus dalam lumpang porselin
dengan bantuan nitrogen cair. Sampel yang telah halus seperti tepung berwarna putih dimasukkan ke dalam tabung 1,5 ml yang telah berisi 1 ml buffer ektraksi
100 mM Tris HCl, 4 M NaCl, 20 mM ED TA, 3 CTAB, 6 PVP dan 0,2 β-
mekaptoetanol yang telah dipanaskan pada suhu 65 C. Larutan dibolak-balik
sampai terbentuk suspensi. Selanjutnya diinkubasi di dalam waterbath pada suhu 65
C selama 30 menit dan setiap 10 menit dibolak-balik. Setelah proses ekstraksi, sampel dibiarkan dingin pada suhu ruang dan dilanjutkan dengan proses
Universitas Sumatera Utara
16 pemurnian. Proses pemurniaan diawali dengan penambahan Tris-Phenol :
Kloroform : Isoamilalkohol 25:24:1 dengan volume yang sama dan dibolak- balik hingga homogen. Larutan disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm pada
suhu 4 C selama 15 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung 1,5 ml yang baru
dan dimurnikan dengan larutan kloroform: isoamilalkohol 24:1 dengan volume yang sama dan dibolak-balik secara teratur, disentrifus dengan kecepatan 10.000
rpm pada suhu 4 C selama 15 menit. Supernatan diambil dengan pipet dan
dipindahkan ke tabung 1,5 ml yang baru dan steril. DNA diendapkan dengan penambahan 110 kali volume sodium asetat pH
5,2 dan 2 kali volume etanol absolut dingin, larutan dibolak-balik beberapa kali sampai DNA terlihat seperti benang-benang putih. DNA diinkubasi pada suhu -
20 C selama 3 jam dan disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4
C selama 15 menit. Supernatan dibuang dan pelet dibersihkan dengan 50 µl alkohol
70 dan disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 C selama 15
menit. DNA dikering-anginkan atau divakum pada suhu 37 C selama 10 menit.
DNA yang telah kering dilarutkan dengan aquabides ddH
2
O steril sebanyak 100 µl.
Kontaminan RNA pada DNA dihilangkan dengan cara menambahkan 5 µl RNAse 20 mgml dan diinkubasi selama 90 menit suhu 37
C. RNAse dinonaktifkan dengan cara diinkubasi pada suhu 70
C selama 3 menit dan selanjutnya disimpan pada suhu -20
C.
3.4.8. Uji Kualitas dan Kuantitas DNA