30 30
2. Two primer, merupakan bagian tertentu untuk memulai dan mengakhiri
fragmen yang akan diamplifikasi. 3.
DNA polymerase, merupakan enzim yang digunakan untuk mengkopi DNA. 4.
Nukleotida, di mana DNA polymerase membangun DNA baru. 5.
Buffer, yang memberikan lingkungan kimia yang cocok untuk DNA polymerase.
Reaksi PCR dilaksanakan dalam thermocycler, di mana mesin PCR memanaskan dan mendinginkan tabung-tabung reaksi yang ada di dalamnya pada
suhu tertentu yang dibutuhkan untuk setiap tahap reaksi Sopian, 2006; Sudjadi, 2008.
II.6.3. Primers
Fragmen DNA yang akan diamplifikasi ditentukan oleh primers yang dipilih. Primers adalah potongan rantai DNA artifisial, tidak lebih dari 50 nukleotid. Oleh
karena DNA biasanya mempunyai rantai ganda, panjangnya diukur dalam pasang basa. Panjang rantai tunggal DNA diukur dalam basa atau nukleotid, yang mana
merupakan pasangan yang tepat dari bagian awal dan akhir fragmen DNA yang akan diamplifikasi. Primers melekat pada DNA template dibagian awal dan akhir, dimana
DNA polymerase mengikat dan memulai sintesis rantai DNA baru Sudjadi, 2008.
II.6.4. Prosedur
Proses PCR berisi satu seri yang terdiri dari 20-30 siklus. Setiap siklus terdiri dari 3 tahap. Pertama, rantai ganda DNA harus dipanaskan hingga 96
o
C untuk memisahkan rantai. Langkah ini disebut melting: di mana ikatan hydrogen yang
p d f Machine
A pdf w rit er t hat produces qualit y PDF files w it h ease
Produce quality PDF files in seconds and preserve the integrity of your original docum ents. Com patible across nearly all Windows platform s, sim ply open the docum ent you want to convert, click “print”, select the
“ Broadgun pdfMachine printer” and that’s it Get yours now
Universitas Sumatera Utara
31 31
menghubungkan dua rantai DNA dipecahkan. Sebelum langkah pertama ini, lama pemanasan sering diperpanjang untuk memastikan bahwa template DNA dan primers
telah terpisah sempurna masing-masing menjadi rantai tunggal. Setelah rantai DNA terpisah, temperatur diturunkan sehingga primers dapat
menempelkan rantainya pada rantai tunggal DNA. Langkah ini disebut annealing. Temperatur pada langkah ini tergantung pada primers dan biasanya 5
o
C di bawah temperatur melting. Temperatur yang salah waktu langkah annealing dapat
menyebabkan primers tidak semuanya terikat pada template DNA atau terikat tidak teratur.
Akhirnya DNA polymerase harus mengisi rantai yang hilang. Ini dimulai pada primers dan terus sepanjang rantai DNA. Langkah ini disebut elongation. Temperatur
elongation tergantung DNA polymerase. Waktu untuk langkah ini tergantung pada DNA polymerase dan panjang rantai DNA yang diamplifikasi
Proses PCR terdiri dari langkah-langkah berikut: Langkah 1 : Initialization
Pemanasan campuran pada temperatur 92
o
C selama 3 menit untuk memastikan rantai DNA dan primers terurai. DNA polymerase dapat
diberikan pada tahap ini atau ditambahkan setelahnya. Langkah 2 : Melting
Pemanasan pada temperatur 92
o
C selama 30 detik. Untuk setiap siklus, waktu tersebut biasanya cukup untuk menguraikan DNA.
p d f Machine
A pdf w rit er t hat produces qualit y PDF files w it h ease
Produce quality PDF files in seconds and preserve the integrity of your original docum ents. Com patible across nearly all Windows platform s, sim ply open the docum ent you want to convert, click “print”, select the
“ Broadgun pdfMachine printer” and that’s it Get yours now
Universitas Sumatera Utara
32 32
Langkah 3 : Annealing Pemanasan pada temperatur 53
o
C selama 30 detik. Langkah 4 : Elongation
Pemanasan pada temperatur 72
o
C selama 1 menit. Langkah 5 : Step 2-5 diulang 40 kali.
Langkah 6 : Pertahankan campuran pada suhu 72
o
C selama 5 menit Ini berguna bila PCR dimulai pada sore hari sebelum meninggalkan
laboratorium, sehingga dapat berproses sepanjang malam. DNA tidak akan rusak pada temperatur 72
o
C setelah semalaman. Hasil PCR dapat diidentifikasi dengan menggunakan agarose gel
electroforesis. Agarose gel electroforesis adalah suatu prosedur yang terdiri dari pengisian DNA dalam agarose gel dan kemudian menghubungkan arus listrik pada
gel. Sebagai hasilnya, rantai DNA yang lebih kecil bergerak lebih cepat dari pada rantai yang lebih besar melalui gel menuju arus positif. Ukuran dari hasil PCR
ditentukan dengan membandingkannya dengan suatu DNA ladder yang ukurannya sudah diketahui yang dimasukkan juga ke dalam gel Sudjadi, 2008.
II.6.5. Reverse Transcriptase