Prosedur Pengertian RT-PCR Secara Umum

30 30 2. Two primer, merupakan bagian tertentu untuk memulai dan mengakhiri fragmen yang akan diamplifikasi. 3. DNA polymerase, merupakan enzim yang digunakan untuk mengkopi DNA. 4. Nukleotida, di mana DNA polymerase membangun DNA baru. 5. Buffer, yang memberikan lingkungan kimia yang cocok untuk DNA polymerase. Reaksi PCR dilaksanakan dalam thermocycler, di mana mesin PCR memanaskan dan mendinginkan tabung-tabung reaksi yang ada di dalamnya pada suhu tertentu yang dibutuhkan untuk setiap tahap reaksi Sopian, 2006; Sudjadi, 2008.

II.6.3. Primers

Fragmen DNA yang akan diamplifikasi ditentukan oleh primers yang dipilih. Primers adalah potongan rantai DNA artifisial, tidak lebih dari 50 nukleotid. Oleh karena DNA biasanya mempunyai rantai ganda, panjangnya diukur dalam pasang basa. Panjang rantai tunggal DNA diukur dalam basa atau nukleotid, yang mana merupakan pasangan yang tepat dari bagian awal dan akhir fragmen DNA yang akan diamplifikasi. Primers melekat pada DNA template dibagian awal dan akhir, dimana DNA polymerase mengikat dan memulai sintesis rantai DNA baru Sudjadi, 2008.

II.6.4. Prosedur

Proses PCR berisi satu seri yang terdiri dari 20-30 siklus. Setiap siklus terdiri dari 3 tahap. Pertama, rantai ganda DNA harus dipanaskan hingga 96 o C untuk memisahkan rantai. Langkah ini disebut melting: di mana ikatan hydrogen yang p d f Machine A pdf w rit er t hat produces qualit y PDF files w it h ease Produce quality PDF files in seconds and preserve the integrity of your original docum ents. Com patible across nearly all Windows platform s, sim ply open the docum ent you want to convert, click “print”, select the “ Broadgun pdfMachine printer” and that’s it Get yours now Universitas Sumatera Utara 31 31 menghubungkan dua rantai DNA dipecahkan. Sebelum langkah pertama ini, lama pemanasan sering diperpanjang untuk memastikan bahwa template DNA dan primers telah terpisah sempurna masing-masing menjadi rantai tunggal. Setelah rantai DNA terpisah, temperatur diturunkan sehingga primers dapat menempelkan rantainya pada rantai tunggal DNA. Langkah ini disebut annealing. Temperatur pada langkah ini tergantung pada primers dan biasanya 5 o C di bawah temperatur melting. Temperatur yang salah waktu langkah annealing dapat menyebabkan primers tidak semuanya terikat pada template DNA atau terikat tidak teratur. Akhirnya DNA polymerase harus mengisi rantai yang hilang. Ini dimulai pada primers dan terus sepanjang rantai DNA. Langkah ini disebut elongation. Temperatur elongation tergantung DNA polymerase. Waktu untuk langkah ini tergantung pada DNA polymerase dan panjang rantai DNA yang diamplifikasi Proses PCR terdiri dari langkah-langkah berikut: Langkah 1 : Initialization Pemanasan campuran pada temperatur 92 o C selama 3 menit untuk memastikan rantai DNA dan primers terurai. DNA polymerase dapat diberikan pada tahap ini atau ditambahkan setelahnya. Langkah 2 : Melting Pemanasan pada temperatur 92 o C selama 30 detik. Untuk setiap siklus, waktu tersebut biasanya cukup untuk menguraikan DNA. p d f Machine A pdf w rit er t hat produces qualit y PDF files w it h ease Produce quality PDF files in seconds and preserve the integrity of your original docum ents. Com patible across nearly all Windows platform s, sim ply open the docum ent you want to convert, click “print”, select the “ Broadgun pdfMachine printer” and that’s it Get yours now Universitas Sumatera Utara 32 32 Langkah 3 : Annealing Pemanasan pada temperatur 53 o C selama 30 detik. Langkah 4 : Elongation Pemanasan pada temperatur 72 o C selama 1 menit. Langkah 5 : Step 2-5 diulang 40 kali. Langkah 6 : Pertahankan campuran pada suhu 72 o C selama 5 menit Ini berguna bila PCR dimulai pada sore hari sebelum meninggalkan laboratorium, sehingga dapat berproses sepanjang malam. DNA tidak akan rusak pada temperatur 72 o C setelah semalaman. Hasil PCR dapat diidentifikasi dengan menggunakan agarose gel electroforesis. Agarose gel electroforesis adalah suatu prosedur yang terdiri dari pengisian DNA dalam agarose gel dan kemudian menghubungkan arus listrik pada gel. Sebagai hasilnya, rantai DNA yang lebih kecil bergerak lebih cepat dari pada rantai yang lebih besar melalui gel menuju arus positif. Ukuran dari hasil PCR ditentukan dengan membandingkannya dengan suatu DNA ladder yang ukurannya sudah diketahui yang dimasukkan juga ke dalam gel Sudjadi, 2008.

II.6.5. Reverse Transcriptase

Dokumen yang terkait

Gambaran Klinis Penderita Demam Berdarah Dengue Pada Anak Di RSUP H. Adam Malik Medan

3 57 83

Gambaran Epidemiologi Penderita Demam Berdarah Dengue (DBD) di Kota Medan tahun 1998-2002

0 47 77

Deteksi Dan Penentuan Virus Gengue Serotpe 1 Dari Serum Penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue Di Rumah Sakit Kota Medan Menggunakan Reverse Transcriptase Polymerase Shain Reaction

0 43 61

Deteksi Dan Penentuan Virus Dengue Serotipe 3 Dari Serum Penderita Demam Dengue/Demam Berdarah Dengue Di Rumah Sakit Kota Medan Menggunakan Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

1 39 65

Deteksi Dan Penentuan Serotipe Virus Dengue Tipe 1 Dari Nyamuk Aedes Aegypti Dengan Menggunakan Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) Di Kota Medan

1 38 80

Deteksi Dan Penentuan Serotipe Virus Dengue Tipe 4 Dari Nyamuk Aedes Aegypti Dengan Menggunakan Metode Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (Rt-Pcr) Di Kota Medan

2 68 68

Frekuensi Virus Dengue Serotipe 4 Dari Serum Penderita DD / BBD Di Rumah Sakit Kota Medan Menggunakan RT-PCR

1 58 73

Deteksi Dan Penentuan Serotipe Virus Dengue Tipe-3 (Den-3) Dari Nyamuk Aedes Aegypti Dengan Menggunakan Reverse Transcriptase- PCR (RT-PCR) Di Kota Medan

1 52 82

Keywords: Dengue infections, serotyping, RT-PCR Pendahuluan - Deteksi dan Serotiping Virus Dengue dan Serum Penderita Demam Dengue di Medan Menggunakan Reverse Transkriptase PCR

0 0 12

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Demam Berdarah Dengue - Prevalensi Demam Berdarah Dengue Di Kota Medan Berdasarkan Data Di Dinas Kesehatan Kota Medan Tahun 2011

0 0 13