BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Penentuan Kondisi Kromatografi untuk Mendapatkan Hasil Analisis yang Optimum
Kadar akrilamida dalam keripik singkong ditentukan dengan KCKT fase balik. Maka untuk dapat memberikan hasil yang baik, terlebih dahulu dicari
kondisi optimal KCKT yang mencakup panjang gelombang analisis, komposisi fase gerak dan laju alir.
Panjang gelombang analisis ditentukan dengan membuat kurva serapan akrilamida baku menggunakan spektrofotometer UV. Spektrum hasil pengukuran
akrilamida baku dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4.
Kurva Serapan Akrilamida Baku 0,5 mcgml secara Spektrofotometri UV.
Universitas Sumatera Utara
Dari hasil penentuan panjang gelombang dengan konsentrasi pengukuran 0,5 mcgml diperoleh panjang gelombang maksimum akrilamida pada 199 nm
dengan serapan 0,517 seperti terlihat pada Gambar 4. Menurut Brown, et.al. 1982 akrilamida memiliki serapan maksimum
pada panjang gelombang sekitar 196-198 nm. Dimana adanya perbedaan panjang gelombang ini masih dalam batas-batas yang diterima menurut Farmakope
Indonesia edisi IV, yaitu ±2 nm. Pada penelitian ini tidak digunakan panjang gelombang 199 nm tetapi
digunakan panjang gelombang 230 nm. Dimana penggunaan panjang gelombang 230 nm akan memberikan kondisi analisis yang baik. Menurut Leung, et.al.
1987, analisis yang dilakukan pada panjang gelombang 190 nm akan menghasilkan noise yang tinggi dan garis alas yang tidak stabil. Dan menurut
Brown, et.al. 1982 sisa ion anorganik yang terelusi cepat sebelum akrilamida, akan terdeteksi lebih kuat pada panjang gelombang 197 nm. Berdasarkan hal
tersebut maka analisis akrilamida dalam penelitian ini dilakukan pada panjang gelombang 230 nm dimana panjang gelombang ini telah digunakan oleh Harahap
2006 untuk menganalisis akrilamida dalam keripik kentang secara KCKT fase balik dengan menggunakan fase gerak asetonitril : aquabidest : asam fosfat 10
5:94:1. Analisis akrilamida secara KCKT fase balik telah dilakukan oleh Harahap
2006 menggunakan fase gerak asetonitril, aquabidest dan asam fosfat 10 dengan perbandingan 5:94:1 dan laju alir 1,2 mlmenit. Pada awal penelitian,
komposisi fase gerak yang sama dengan laju alir 1 mlmenit telah dicoba untuk
Universitas Sumatera Utara
larutan akrilamida baku 10 mcgml, tetapi diperoleh kromatogram yang kurang baik, seperti yang terlihat pada Gambar 5.
Gambar 5.
Kromatogram Hasil Penyuntikan Baku Akrilamida dengan Komposisi Fase Gerak Asetonitril : Aquabidest : Asam Fosfat 10
5:94:1 dengan Laju Alir 1,0 mlmenit
Kemudian peneliti mencoba untuk memvariasikan komposisi fase gerak dengan laju alir 1 mlmenit yang akan memberikan kondisi kromatografi yang
lebih baik dari yang sebelumnya. Dimana laju alir tidak divariasikan, hal ini disebabkan pada laju alir 1 mlmenit telah memberikan waktu tambat yang
singkat. Data analisis KCKT dengan berbagai perbandingan komposisi fase gerak pada laju alir 1,0 mlmenit dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1.
Data Hasil Analisis Akrilamida Baku 10 mcgml pada Berbagai Perbandingan Komposisi Fase Gerak dengan Laju Alir 1,0 mlmenit
Perbandingan Komposisi Fase Gerak Waktu
Tambat menit
Luas Puncak
Jumlah Lempeng
Teoritis Asetonitril Aquabidest Asam Fosfat 10
5 94
1 4,250
4,430 97965
71182 7014,950
7304,168 10
89 1
3,843 3,975
73382 50523
8086,563 8401,604
15 84
1 3,697
374532 1643,125
20 79
1 3,483
383121 2795,068
Universitas Sumatera Utara
Tabel 1 menunjukkan bahwa semakin besar konsentrasi asetonitril dalam fase gerak, maka waktu tambat akrilamida semakin singkat. Hal ini dikarenakan
kekuatan pelarut solvent strength, di mana pada kromatografi fase terbalik, konsentrasi asetonitril yang lebih besar akan mengakibatkan fase gerak semakin
kuat sehingga proses elusi terjadi lebih cepat dan nilai faktor kapasitas k’ menjadi semakin kecil, oleh karena itu waktu tambat analit menjadi singkat. Dari
pengamatan selama analisis, diketahui bahwa konsentrasi asetonitril yang semakin rendah dalam fase gerak akan mengakibatkan pecahnya peak doubling peaks.
Hal ini kemudian menjadi dasar peneliti memilih menggunakan fase gerak asetonitril : aquabidest : asam fosfat 10 dengan perbandingan 20:79:1.
Kromatogram dapat dilihat pada Gambar 6.
Gambar 6.
Kromatogram Hasil Penyuntikan Baku Akrilamida dengan Komposisi Fase Gerak Asetonitril : Aquabidest : Asam Fosfat 10
20:79:1 dengan Laju Alir 1,0 mlmenit
Hasil optimasi pada baku kemudian diterapkan untuk orientasi sampel, hal ini dilakukan karena sampel merupakan matriks biologi yang memiliki banyak
Universitas Sumatera Utara
senyawa-senyawa ikutan lainnya. Pada awalnya sampel dianalisis menggunakan kondisi KCKT sesuai optimasi dengan komposisi fase gerak asetonitril :
aquabidest : asam fosfat 10 20:79:1 dan diperoleh hasil kromatogram yang
kurang baik yaitu tidak terlihat puncak akrilamida yang terdapat dalam sampel seperti terlihat pada Gambar 7. Puncak akrilamida pada sampel Kampung Lalang
dapat dilihat setelah ditambahkan sedikit larutan baku 10 mcgml spiking ke dalam larutan sampel Kampung Lalang seperti terlihat pada Gambar 8.
Gambar 7.
Kromatogram Hasil Penyuntikan Sampel Keripik Singkong yang Berasal dari Kampung Lalang dengan Komposisi Fase Gerak
Asetonitril : Aquabidest : Asam Fosfat 10 20:79:1 dengan Laju Alir 1,0 mlmenit
Universitas Sumatera Utara
Gambar 8.
Kromatogram Hasil Spike Keripik Singkong yang berasal dari Kampung Lalang dengan Baku Akrilamida 10 mcgml dan
Komposisi Fase Gerak Asetonitril : Aquabidest : Asam Fosfat 10 20:79:1 dengan Laju Alir 1,0 mlmenit
Untuk mengatasi kromatogram sampel yang kurang baik tersebut maka dilakukan orientasi dengan memvariasikan perbandingan fase gerak yaitu
asetonitril : larutan asam fosfat 21,7 mM 15:85, asetonitril : larutan asam fosfat 21,7 mM 10:90 dan asetonitril : larutan asam fosfat 21,7 mM 5:95.
Kromatogram akrilamida sampel yang terbaik diperoleh pada perbandingan asetonitril : larutan asam fosfat 21,7 mM 5:95 seperti terlihat pada Gambar 9.
Kromatogram dengan komposisi fase gerak lainnya dapat dilihat pada lampiran 1 halaman 48 dan 49.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 9.
Kromatogram Hasil Penyuntikan Sampel Keripik Singkong yang berasal dari Kampung Lalang dengan Komposisi Fase Gerak
Asetonitril : Larutan Asam Fosfat 21,7 mM 5:95 dan Laju Alir 1,0 mlmenit
4.2 Penyiapan Larutan Sampel
Kategori