fisik dari fase air beku. Fase air yang membeku kemudian dibiarkan mencair. Larutan ini kemudian disebut sebagai larutan sampel Levita, et.al., 2006.
3.4.2 Prosedur Analisis 3.4.2.1 Penyiapan Alat KCKT
Kolom yang digunakan adalah Shim-Pack VP-ODS 4,6 x 250 mm. KCKT menggunakan detektor UV. Pompa menggunakan mode aliran tetap
dengan low-pressure gradient system untuk memperoleh komposisi fase gerak yang konstan selama analisis sistem elusi isokratik.
Setelah alat KCKT dihidupkan, maka pompa dijalankan dan fase gerak dibiarkan mengalir selama ±30 menit sampai diperoleh garis alas yang datar
pertanda sistem kromatografi telah stabil.
3.4.2.2 Penentuan Komposisi Fase Gerak
Kondisi kromatografi divariasikan untuk mendapatkan hasil analisis yang optimum. Kondisi kromatografi yang divariasikan adalah perbandingan fase gerak
yaitu asetonitril, aquabidest dan asam fosfat 10 divariasikan 5:94:1, 10:89:1, 15:84:1 dan 20:79:1; asetonitril dengan larutan asam fosfat 21,7 mM dengan
perbandingan 5:95, 10:90 dan 15:85.
3.4.2.3 Analisis Kualitatif
Analisis kualitatif akrilamida dapat dilakukan dengan membandingkan waktu tambat yang sama identik dari kromatogram pada penyuntikan larutan
sampel dengan kromatogram pada penyuntikan larutan baku pembanding akrilamida pada kondisi KCKT yang sama. Untuk mempertegas identifikasi ini,
sedikit larutan baku pembanding akrilamida ditambahkan spiking ke dalam larutan sampel, lalu dianalisis kembali dengan KCKT. Puncak dengan waktu
Universitas Sumatera Utara
tambat yang sama diamati kembali dan dibandingkan antara kromatogram hasil spiking
dengan kromatogram larutan sampel sebelum spiking. Sampel dinyatakan mengandung akrilamida jika terjadi peningkatan tinggi dan luas puncak pada
kromatogram hasil spiking dengan waktu tambat yang sama seperti pada kromatogram penyuntikan larutan baku pembanding Rohman, 2007.
3.4.2.4 Analisis Kuantitatif 3.4.2.4.1 Penentuan Linieritas Kurva Kalibrasi Baku Pembanding
Akrilamida
Konsentrasi yang digunakan pada pembuatan kurva kalibrasi baku pembanding akrilamida adalah 0,1; 1,6; 2,4; 3,2; 4,8; dan 5,2 mcgml. Larutan
dengan konsentrasi 0,1 mcgml dibuat dengan cara memipet larutan induk baku pembanding ketiga konsentrasi 10 mcgml sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam
labu tentukur 100 ml, lalu diencerkan dengan pelarut sampai garis tanda, sedangkan untuk konsentrasi 1,6; 2,4; 3,2; 4,8 dan 5,2 mcgml dipipet larutan
induk baku pembanding ketiga konsentrasi 10 mcgml 4, 6, 8, 12 dan 13 ml; dimasukkan ke dalam labu tentukur 25 ml, kemudian diencerkan dengan pelarut
sampai garis tanda. Masing-masing larutan disaring melalui penyaring membran Cellulose
Nitrate 0,2 μm dan diawaudarakan selama ±20 menit. Setelah itu, filtrat larutan
baku pembanding disuntikkan sebanyak 20 μl ke dalam sistem KCKT melalui
injektor dengan loop 20 μl. Direkam kromatogram dan dibuat kurva kalibrasi
antara luas puncak dengan konsentrasi, lalu dihitung persamaan regresi dan koefisien korelasi. kromatogram dan data perhitungan dapat dilihat pada
lampiran 3 dan 4.
Universitas Sumatera Utara
3.4.2.4.2 Penetapan Kadar Akrilamida dalam Sampel
Larutan sampel yang telah disiapkan seperti pada bagian 2.4.1.4 disaring dengan menggunakan penyaring membran Cellulose Nitrate
0,2 μm dan diawaudarakan selama ±20 menit. Kemudian disuntikkan sebanyak 20
μl ke dalam sistem KCKT melalui injektor dengan loop 20
μl, menggunakan sistem elusi isokratik dengan fase gerak asetonitril dan larutan asam fosfat 21,7 mM di
mana perbandingan komposisi dan laju alir sesuai dengan hasil optimasi. Deteksi menggunakan detektor UV pada panjang gelombang hasil optimasi. Direkam
kromatogram dan dicatat luas puncak. Kromatogram dapat dilihat pada Lampiran 5, 7, 9, 11, 13 dan 15.
Kadar akrilamida yang terdapat dalam larutan sampel X dihitung dengan mensubstitusikan luas puncak ke dalam persamaan regresi yang diperoleh dari
kurva kalibrasi pada bagian 2.4.2.3.1 sebagai Y. Hasilnya lalu dikali volume larutan sampel 25 ml, kemudian dibagi dengan berat penimbangan sampel
keripik singkong sehingga diperoleh kadar akrilamida dengan satuan mcgg sampel.
Rumus perhitungan kadar akrilamida dalam sampel dituliskan sebagai berikut: Kadar Akrilamida mcgg sampel =
sampelml larutan
Volume x
mcgml g
sampel n
penimbanga berat
X
Contoh perhitungan untuk mencari kadar dapat dilihat pada Lampiran 18
3.4.2.5 Analisis Data Penetapan Kadar Secara Statistik
Data perhitungan kadar akrilamida pada bagian 2.4.2.3.2 dianalisis secara statistik menggunakan uji t.
Menurut Rohman 2007, rumus yang digunakan untuk menghitung simpangan baku adalah:
Universitas Sumatera Utara
SD = 1
2
− −
∑
n X
X
Sedangkan untuk mendapatkan t
hitung
digunakan rumus: t
hitung
= n
SD X
X −
Data diterima jika –t
tabel
t
hitung
t
tabel
pada interval kepercayaan 95 dengan derajat kebebasan dk = n-1 dan nilai
α = 0,05. Keterangan:
SD = standard deviationsimpangan baku X = kadar akrilamida
= kadar rerata akrilamida n = jumlah perlakuan
Untuk menghitung kadar akrilamida dalam sampel secara statistik digunakan rumus:
Kadar Akrilamida µ = X ± t
1- 12αdk
x
n SD
Keterangan: μ = kadar akrilamida
t = harga t
tabel
sesuai dengan derajat kepercayaan α = tingkat kepercayaaan
dk = derajat kebebasan Data perhitungan penetapan kadar secara statistik dapat dilihat pada Lampiran 6,
8, 10, 12, 14 dan 16
Universitas Sumatera Utara
3.4.3 Validasi Metode 3.4.3.1 Akurasi
Akurasi ditentukan dengan menggunakan metode penambahan baku the method of standard additives
, yakni ke dalam sampel keripik singkong ditambahkan akrilamida baku sebanyak 150 dari kadar akrilamida yang
diketahui terdapat dalam sampel, kemudian dianalisis dengan prosedur yang sama seperti pada sampel. Hasil dinyatakan dalam persen perolehan kembali
recovery . Persen perolehan kembali dapat dihitung dengan menggunakan rumus
sebagai berikut: perolehan kembali =
C B
A −
x 100 Keterangan:
A = konsentrasi sampel yang diperoleh setelah penambahan akrilamida baku B = konsentrasi sampel sebelum penambahan akrilamida baku
C = konsentrasi baku yang ditambahkan Contoh perhitungan persen perolehan kembali dapat dilihat pada Lampiran 21
Data perolehan kembali dapat dilihat pada Lampiran 20
3.4.3.2 Presisi
Presisi metode penelitian dinyatakan oleh simpangan baku relatif Relative Standard Deviation
RSD dari serangkaian data. RSD dapat dirumuskan sebagai berikut.
RSD = X
SD x 100
Universitas Sumatera Utara
