2.1.5 Metode Analisis
Metode yang dapat digunakan untuk menganalisis kadar akrilamida dalam sampel makanan, antara lain kromatografi gas spektrometri massa Rothweiler,
2004, kromatografi cair–spektrometri massa tandem Takatsuki, 2002 dan kromatografi cair kinerja tinggi Harahap, 2006; Tanseri, 2009.
Akrilamida memiliki berat molekul 71,08 dengan kelarutan yakni 215 gL air pada suhu 25°C. Oleh karena itu, dapat dikatakan bahwa akrilamida
merupakan suatu senyawa dengan kepolaran yang tinggi dan bila diitinjau dari struktur molekulnya, akrilamida memiliki ikatan rangkap terkonjugasi CH2=CH–
CO–NH2 dan gugus kromofor yang dapat menyerap sinar UV Castle, 2006. Hal ini mendasari penggunaan KCKT fase balik reversed phase high
performance liquid chromatography dengan detektor UV untuk analisis
akrilamida dalam sampel.
2.2 Mekanisme Terbentuknya Akrilamida dalam Makanan yang Digoreng
Banyak senyawa hasil reaksi maillard yang penting untuk karakteristik warna, rasa dan aroma pada makanan yang dipanaskan. Namun beberapa senyawa
ini ada yang tidak bermanfaat atau bahkan bersifat toksik bila dikonsumsi. Salah satu hasil reaksi maillard yang toksik adalah akrilamida. Reaksi maillard, dalam
berbagai penelitian, disimpulkan sebagai jalur utama bagi pembentukan akrilamida. Reaksi maillard merupakan suatu reaksi kompleks yang terjadi antara
senyawa karbonil umumnya gula pereduksi dengan suatu amina biasanya berupa suatu asam amino, peptida atau protein. Reaksi ini pertama sekali
dikemukakan oleh Louis-Camille Maillard pada tahun 1912.
Universitas Sumatera Utara
Mekanisme pembentukan akrilamida dalam reaksi maillard diperkirakan berawal dari interaksi antara senyawa karbonil dengan asam amino asparagin
selama proses pemanasan berlangsung. Hasil interaksi ini yakni basa Schiff, kemudian mengalami dekarboksilasi dalam reaksi Strecker menjadi suatu
senyawa antara yang tidak stabil. Senyawa antara ini yaitu suatu basa Schiff yang terdekarboksilasi, lalu mengalami hidrolisis menjadi 3-aminopropanamida, yang
kemudian bagian amonia-nya tereliminasi membentuk akrilamida. Basa Schiff yang terdekarboksilasi ini juga dapat membentuk akrilamida secara langsung
lewat reaksi eliminasi imina Mottram, et.al., 2006. Skema pembentukan
akrilamida dapat dilihat pada Gambar 2.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 2.
Skema Pembentukan Akrilamida Lewat Reaksi Mailard sumber: Wedzicha et al., 2005 dan Zyzak et al., 2003
2.3 Teori Kromatografi 2.3.1 Sejarah
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau KCKT atau biasa juga disebut dengan HPLC High Perfomance Liquid Chromatography dikembangkan pada
akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa
tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain: farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer, dan analisis senyawa-senyawa kiral Rohman,
2007.
2.3.2 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT
Kromatografi cair kinerja tinggi merupakan metode pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi tinggi yang dapat mengidentifikasi serta menetapkan
secara kuantitatif bahan dalam jumlah yang sangat kecil. KCKT mempunyai kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang
sensitif. Dengan teknologi ini, kromatografi cair dapat menghasilkan pemisahan yang cepat dalam banyak hal, dengan keunggulan zat-zat yang tidak menguap
atau tidak tahan panas dapat dikromatografi tanpa peruraian atau tanpa perlu membuat derivat yang dapat menguap Ditjen POM, 1995.
Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian
impurities dan analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap nonvolatil. KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-
senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat dan protein-
Universitas Sumatera Utara
protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat dan lain-lain Rohman, 2007.
2.3.3 Jenis Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Pemisahan dengan KCKT dapat dilakukan dengan fase normal jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya atau fase terbalik jika fase
diamnya lebih non polar dibanding dengan fase geraknya. Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali KCKT dikelompokkan menjadi KCKT fase
normal dan KCKT fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, KCKT juga dapat dikelompokkan berdasarkan
pada sifat fase diam, yaitu: kromatografi adsorpsi, kromatografi terikat, kromatografi penukar ion, kromatografi pasangan ion, kromatografi eksklusi
ukuran, dan kromatografi afinitas. Kromatografi fase terikat menggunakan fase diam dari silika yang
dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silikia adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan
oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan ODS atauC
18
dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik Rohman, 2009.
2.3.4 Komponen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Menurut De Lux Putra 2004, komponen KCKT pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel tempat injeksi,
kolom, detektor, wadah pembuangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.
Universitas Sumatera Utara
Gambar 3.
Instrumen Dasar KCKT
2.3.4.1 Wadah Fase Gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan inert, seperti wadah pelarut kosong ataupun labu labolatorium. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak
antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil. Selain itu, adanya gas
dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan
mengacaukan analisis.
2.3.4.2 Pompa
Pompa berfungsi menarik fase gerak dari wadah dan memompanya menuju kolom. Pompa harus mampu menghasilkan tekanan 6000 psi pada
kecepatan alir 0,1-10 mlmenit. Pompa terbuat dari bahan yang inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum digunakan adalah gelas, baja antikarat, teflon, dan batu
nilam. Tujuan penggunaan pompa adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reproduksibel, konstan, dan bebas dari
gangguan.
Universitas Sumatera Utara
Ada 2 jenis pompa dalam KCKT yaitu pompa dengan aliran fase gerak yang tetap dan pompa dengan tekanan konstan.
2.3.4.3 Injektor
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir dibawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik
yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon. Ada tiga jenis dasar injektor, yaitu:
a. Hentikan aliranstop flow : aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja
atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam aliran kecil dan resolusi tidak dipengaruhi.
b. Septum : injektor-injektor langsung ke aliran fase gerak umumnya sama
dengan yang digunakan pada kromatografi gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan
semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Selain itu, partikel kecil dari septum yang terkoyak akibat jarum injektor dapat menyebabkan penyumbatan.
c. Katup putaran loop valve : tipe injektor ini umumnya digunakan untuk
menginjeksi volume lebih besar dari pada 10 μl dan sekarang digunakan dengan cara automatis dengan adaptor khusus, volume-volume lebih kecil
dapat diinjeksikan secara manual. Pada posisi LOAD, sampel loop cuplikan dalam putaran diisi pada tekanan atmosfir. Bila katup difungsikan, maka
cuplikan di dalam putaran akan bergerak ke dalam kolom.
Universitas Sumatera Utara
2.3.4.4 Kolom
Kolom merupakan jantung kromatografi. Keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung pada pilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat
dibagi menjadi dua kelompok : a.
Kolom analitik : diameter dalam 2-6 mm. Panjang bergantung pada jenis kemasan, untuk kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50-100 cm,
untuk kemasan mikropartikel berpori biasanya 10-30 cm; b.
Kolom preparatif : umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar dan panjang 25-100 cm
Kolom umumnya terbuat dari stainless steel. Kolom biasanya dipakai pada suhu kamar, tetapi suhu yang yang lebih tinggi juga dipakai, terutama dalam
kromatografi pertukaran ion dan kromatografi eksklusi.
2.3.4.5 Detektor
Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu : 1.
Detektor universal : mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif, seperti detektor indeks bis dan detektor
spektrometri massa. 2.
Detektor spesifik : hanya mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi dan elektrokimia.
2.3.4.6 Perekam
Alat pengumpul data seperti komputer, integrator, rekorder dihubungkan dengan detektor. Alat ini akan mengukur sinyal elektronik yang dihasilkan oleh
detektor lalu mem-plotkannya sebagai suatu kromatogram yang selanjutnya dapat dievaluasi oleh seorang analis.
Universitas Sumatera Utara
2.3.5 Parameter Kromatografi
Ada beberapa parameter kromatografi yang digunakan secara umum,
yaitu:
1. Waktu Tambat Waktu Retensi Jarak antara puncak maksimal dari titik injeksi yang dinyatakan dalam unit
waktu disebut waktu retensi. Waktu retensi berfungsi sebagai pengidentifikasi analit pada sistem partikuler.
Waktu retensi merupakan deskriptor yang paling luas digunakan untuk analit, dan parameter yang paling mudah diukur. Walaupun mudah diukur, waktu
retensi merupakam parameter universal yang paling akhir. Waktu retensi analit tergantung pada laju alir fase gerak dan stabilitas laju
alir. Semakin cepatlaju alir, semakin singkat waktu retensi Dong, 2006. 2. Resolusi
Tujuan sederhana dan bahkan sangat penting dalam KCKT adalah mendapatkan pemisahan campuran sampel yang baik. Untuk mencapai tujuan
inikita perlu menghitung ukuran kunatitatif dari pemisahan relatif atau resolusi. Resolusi, Rs, dari dua puncak berdekatan didefinisikan sebagai perbandingan
jarak antara dua puncak, dibagi dengan rata-rata lebar puncak. Rumusnya : Rs
=
2 1
1 2
2
w w
t t
t t
+ −
Dimana : t
1
dan t
2
= waktu retensi puncak 1 dan 2 t
w1
dan t
w2
= lebar puncak 1 dan 2 Nilai Rs mendekati atau lebih dari 1,5 akan memberikan pemisahan yang
baik.
Universitas Sumatera Utara
3. Efisiensi Kolom Salah satu karakteristik sistem kromatografi yang paling penting adalah
efisiensi atau jumlah lempeng teoritis. Bilangan lempeng N yang tinggi disyaratkan untuk pemisahan yang baik yang nilainya semakin kecilnya nilai H.
Istilah H merupakan tinggi ekivalen lempeng teoritis atau HETP high equivalent theoretical plate
yang mana merupakan panjang kolom yang dibutuhkan untuk menghasilkan satu lempeng teoritis. Kolom yang baik akan mempunyai bilangan
lempeng yang tinggi dan nilai H yang rendah, untuk mencapai hal ini ada beberapa faktor yang mendukung yaitu kolom yang dikemas dengan baik, kolom
yang lebih panjang, partikel fase diam yang lebih kecil, viskositas fase gerak yang lebih rendah dan suhu yang lebih tinggi, molekul-molekul sampel yang lebih
kecil, dan pengaruh di luar kolom yang minimal Rohman, 2007.
4. Faktor Asimetri Hal-hal yang menyebabkan terjadinya puncak yang asimetris, yaitu :
a. Ukuran sampel yang dianalisis terlalu besar. Jika sampel terlalu besar maka
fase gerak tidak mampu membawa solut dengan sempurna karenanya terjadi pengekoran atau tailing.
b. Interaksi yang kuat antara solut dengan fase diam dapat menyebabkan solut
sukar terelusi sehingga dapat menyebabkan terbentuknya puncak yang mengekor.
c. Adanya kontaminan dalam sampel yang dapat muncul terlebih dahulu sehingga
menimbulkan puncak mendahului fronting Rohman, 2007.
Universitas Sumatera Utara
2.4 Validasi
Validasi adalah suatu tindakan terhadap parameter tertentu pada prosedur penetapan yang dipakai untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi
persyaratan untuk penggunaannya. Validasi dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis yang dilakukan akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan pada
kisaran analit yang akan dianalisis WHO, 1992; Rohman, 2007. Parameter analisis yang ditentukan pada validasi adalah akurasi, presisi,
spesifikasi, limit deteksi, limit kuantitasi, linieritas dan rentang kadar. Akurasi kecermatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan
hasil analisis dengan kadar analit sebenarnya. Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali recovery analit yang ditambahkan dan dapat ditentukan
melalui dua cara, yaitu metode simulasi spiked placebo recovery dan metode penambahan bahan baku standard addition method. Dalam kedua metode
tersebut, persen perolehan kembali dinyatakan sebagai rasio antara hasil yang diperoleh dengan hasil yang sebenarnya.
Perolehan Kembali = 100
x C
B A
−
Keterangan : A = konsentrasi sampel yang diperoleh setelah penambahan baku B = konsentrasi sampel sebelum penambahan baku
C = konsentrasi baku yang ditambahkan Presisi dari suatu metode analisis adalah derajat kesesuaian diantara
masing-masing hasil uji, jika prosedur analisis diterapkan berulang kali pada sejumlah cuplikan yang diambil dari sampel homogen. Presisi dinyatakan sebagai
deviasi standar atau deviasi standar relatif koefisien variasi. Presisi dapat
Universitas Sumatera Utara
diartikan pula sebagai derajat reprodusibilitas atau keterulangan dari prosedur analisis. Ada 4 macam ukuran ketepatan, yaitu :
a. Kisaran range kadar merupakan selisih hasil penetapan yang paling besar
dengan yang paling kecil. Semakin kecil selisihnya berarti hasilnya semakin tepat.
b. Deviasi rata-rata mean deviation merupakan deviasi masing-masing hasil
penetapan terhadap rata-rata, dengan tidak memperhatikan tanda deviasinya positif atau negatif dan dirumuskan sebagai berikut :
d = c.
Standar deviasi SD merupakan akar jumlah kuadrat deviasi masing-masing hasil penetapan terhadap mean dibagi dengan derajat kebebasannya yang
dinyatakan dalam rumus berikut :
Keterangan : X = nilai dari masing-masing pengukuran
X = rata-rata mean dari pengukuran
N = frekuensi penetapan N-1 = derajat kebebasan
d. Standar deviasi relatif relative standard deviation, RSD merupakan ukuran
ketepatan relatif dan umumnya dinyatakan dalam persen. RSD dirumuskan dengan persamaan :
RSD =
N X
X |
| −
∑
1
2
− −
=
∑
n X
X SD
100 x
X SD
Universitas Sumatera Utara
Keterangan : RSD = Relative Standard Deviation SD = Standard Deviation
X = rata-rata
Kespesifikan dari suatu metode analisis adalah kemampuannya untuk mengukur kadar analit secara khusus dengan akurat, disamping komponen lain
yang terdapat dalam matriks sampel. Batas deteksi limit of detection didefinisikan sebagai konsentrasi analit
terendah dalam sampel yang masih dapat terdeteksi. Batas deteksi dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Batas deteksi =
Slope xSB
3
Batas kuantitasi limit of quantitation didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi
yang dapat diterima pada kondisi operasional metode yang digunakan. Batas Kuantitasi =
Slope xSB
10
Kelinieran suatu metode analisis adalah kemampuan untuk menunjukkan bahwa nilai hasil uji langsung atau setelah diolah secara matematika, proporsional
dengan konsentrasi analit dalam sampel dalam batas rentang konsentrasi tertentu Harmita, 2004; Rohman, 2007.
Universitas Sumatera Utara
BAB III METODOLOGI
Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif yang dilakukan di Laboratorium Penelitian, Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan,
pada bulan Mei hingga Juni 2010.
3.1 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi seperangkat instrumen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT Shimadzu Prominence series dengan
injektor Rheodyne 7225i, kolom Shim-Pack VP-ODS 4,6 x 250 mm dan detektor UVVis SPD 20 A; syringe 100 μl SGE; sonifikator Branson 1510;
pompa vakum Gast DOA-P604-BN; alat penyaring fase gerak dan sampel dilengkapi dengan penyaring membran Whatman Cellulose Nitrate
0,45 μm dan PTFE 0,5 μm dengan diameter 47 mm serta Cellulose Nitrate 0,2 μm dengan
diameter 13 mm; neraca analitik Boeco BBL31; spektrofotometer UV-Vis Shimadzu 1800; laboratory shaker Julabo SW 22; hot plate Fisons;
sentrifugator Janetzki T5; alat destilasi serta peralatan gelas yang umumnya digunakan dalam laboratorium analitik Gambar alat dapat dilihat pada Lampiran
25 dan 26.
3.2 Bahan
Bahan yang digunakan jika tidak dinyatakan lain merupakan kualitas p.a. pro analysis keluaran E.Merck antara lain diklorometan, etanol, asam fosfat
85, metanol, asetonitril, akrilamida for synthesis sertifikat analisis dapat dilihat pada Lampiran 23 dan aquabidest PT. Ikapharmindo Putramas.
Universitas Sumatera Utara
Kategori