21
BAB III METODE PENELITIAN
Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimental, meliputi pengumpulan tumbuhan, pembuatan simplisia, karakterisasi dan skrining
fitokimia simplisia dan ekstrak, pembuatan ekstrak etanol biji alpukat, karakterisasi dan skrining fitokimia ekstrak, penyiapan hewan percobaan,
perlakuan pada hewan percobaan, pengujian efek antihiperurisemia ekstrak etanol biji alpukat pada mencit putih jantan dengan penginduksi potassium oxonate. Data
hasil penelitian dianalisis dengan menggunakan program SPSS 18 Statistical Product and Service Solution
.
3.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini meliputi alat pengukur kadar asam urat Easy Touch
®
, aluminium foil, blender Philip, lemari pengering, mikroskop, neraca listrik Mettler Toledo, neraca hewan GW-1500, rotary
evaporator Heidolph WB 2000, perkolator, seperangkat alat destilasi penetapan
kadar air, stopwatch, spuit 1 mL , oral sonde, mortar dan stamfer, dan alat-alat gelas.
3.2 Bahan-bahan
Bahan kimia yang digunakan adalah etanol 96 teknis, pereaksi Bouchardat, Dragendorff, Mayer, besi III klorida 4,5 bv, Molish, timbal II
asetat 0,4 M, asam sulfat 6 N, asam klorida 2 N, Lieberman-Burchard, toluena, kloroform, asam klorida, kloralhidrat, Na-CMC Natrium -Carboxy Methyl
Cellulose , potassium oxonate, allopurinol teknis, hati ayam, buah melinjo dan
akuades teknis.
Universitas Sumatera Utara
22
3.3 Prosedur Pembuatan Simplisia
3.3.1 Pengumpulan bahan tanaman
Bahan tanaman yang digunakan adalah biji alpukat Persea americana Mill yang segar. Pengumpulan bahan tanaman dilakukan secara purposif tanpa
membandingkan dengan tanaman yang sama dari daerah lain. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah biji alpukat segar yang dibeli di toko buah
Jalan Panglima Denai Medan.
3.3.2 Identifikasi tanaman
Identifikasi tanaman dilakukan di “Herbarium Bogoriense”, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi
– LIPI Bogor. 3.3.3 Pembuatan simplisia
Bahan tanaman biji alpukat yang masih segar dikumpulkan, dicuci bersih di bawah air mengalir, ditiriskan dan ditimbang berat basahnya. Biji alpukat
selanjutnya diiris berbentuk bulat tipis dengan diameter ±3 cm, kemudian dikeringkan di lemari pengering hingga kering, dibuang benda-benda asing atau
pengotoran-pengotoran lain yang masih tertinggal pada simplisia sortasi kering, ditimbang berat keringnya kemudian diserbuk dan disimpan dalam wadah plastik
yang tertutup rapat.
3.4 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia dan Ekstrak
Pemeriksaan karakteristik simplisia dan ekstrak meliputi pemeriksaan makroskopik, mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari larut air,
penetapan kadar sari larut etanol, penetapan kadar abu total dan penetapan kadar abu tidak larut dalam asam Depkes RI, 1995.
Universitas Sumatera Utara
23
3.4.1 Pemeriksaan Makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk dari biji alpukat segar dan simplisia biji alpukat.
3.4.2 Pemeriksaan Mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia biji alpukat. Biji alpukat dipotong melintang lalu diletakkan di atas kaca objek yang
telah ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, selanjutnya diamati di bawah mikroskop.
3.4.3 Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan menurut metode Azeotropi destilasi toluen. Alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, pendingin, tabung penyambung,
tabung penerima 5 ml berskala 0,05 ml, alat penampung dan pemanas listrik. Cara kerja: Dimasukkan 200 ml toluen dan 2 ml air suling ke dalam labu alas
bulat, lalu didestilasi selama 2 jam. Setelah itu, toulen dibiarkan mendingin selama 30 menit, dan dibaca volume air pada tabung penerima dengan ketelitian
0,05 ml. Kemudian ke dalam labu tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah
toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur lebih kurang 2 tetes tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan tetesan dinaikkan hingga 4
tetes tiap detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima
dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca
sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen WHO, 1998.
Universitas Sumatera Utara
24
3.4.4 Penetapan kadar sari larut air
Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling sampai 1 liter dalam labu
bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, lalu disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan sampai
kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah ditara dan sisa dipnaskan pada suhu 105°C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang
larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.
3.4.5 Penetapan kadar sari larut etanol
Sebanyak 5 g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama,
kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan
penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105°C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam
etanol 96 dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.
3.4.6 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2 g serbuk simplisia dan ekstrak dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan-
lahan sampai arang habis, jika arang masih tidak dapat dihilangkan, ditambahkan air panas, saring melalui kertas saring bebas abu. Pijarkan sisa dan kertas saring
dalam krus yang sama. Masukkan filtrat ke dalam krus, uapkan, pijarkan hingga bobot tetap, timbang. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan
Depkes RI, 1995.
Universitas Sumatera Utara
25
3.4.7 Penetapan kadar abu tidak larut asam
Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu didihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu, cuci dengan air panas, dipijarkan, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai bobot tetap. Kadar abu
yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995.
3.5 Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia serbuk simplisia dan ekstrak meliputi pemeriksaan senyawa golongan flavonoid, alkaloid, saponin, tannin, dan steroidtriterpenoid.
3.5.1 Pemeriksaan flavonoid
Serbuk simplisia dan ekstrak masing-masing ditimbang 0,5 g, lalu ditambahkan 10 ml metanol, direfluks selama 10 menit, disaring panas-panas
melalui kertas saring. Filtrat diencerkan dengan 10 ml air suling, setelah dingin ditambahkan 5 ml petroleum eter, dikocok hati-hati, lalu didiamkan sebentar.
Lapisan metanol diambil, diuapkan pada temperatur 40°C, sisanya dilarutkan dalam 5 ml etilasetat, disaring. Filtratnya digunakan untuk uji flavonoid dengan
cara berikut: a.
sebanyak 1 ml filtrat diuapkan sampai kering, sisa dilarutkan dalam 2 ml etanol 96, lalu ditambah 0,5 g serbuk Zn dan 2 ml asam klorida 2 N. Didiamkan
selama 1 menit. Kemudian ditambahkan 10 tetes asam klorida pekat. Jika dalam waktu 2-5 menit terjadi warna merah intensif menunjukkan adanya
flavonoid glikosida-3-flavonol. b. sebanyak 1 ml filtrat diuapkan sampai kering, sisa dilarutkan dalam 1-2 ml
etanol 96, lalu ditambah 0,1 g serbuk Mg dan 10 tetes asam klorida pekat.
Universitas Sumatera Utara
26 Jika terjadi warna merah jingga sampai warna merah ungu menunjukkan
adanya flavonoid. Jika terjadi warna kuning jingga menunjukkan adanya flavon, kalkon dan auron Depkes RI, 1995.
3.5.2 Pemeriksaan alkaloid
Serbuk simplisia dan ekstrak masing-masing ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2N dan 9 ml air suling, dipanaskan di
atas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat yang diperoleh dipakai untuk tes alkaloid. Diambil 3 tabung reaksi, lalu ke dalamnya dimasukkan
0,5 ml filtrat. Pada masing-masing tabung reaksi: a.
ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer b.
ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat c.
ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff Alkaloid positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada dua dari tiga percobaan
di atas Depkes RI, 1995.
3.5.3 Pemeriksaan glikosida
Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 3 g, lalu disari dengan 30 ml campuran dari 7 bagian etanol 96 dengan 3 bagian air suling 7:3 dan 10 ml
asam klorida 2 N, kemudian direfluks selama 10 menit, didinginkan, lalu disaring. Diambil 20 ml filtrat ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4
M dikocok, didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran isopropanol dan kloroform 2:3, perlakuan ini diulangi sebanyak 3 kali. Sari
organik dikumpulkan dan ditambahkan Na
2
SO
4
anhidrat, disaring, kemudian diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50ºC, sisanya dilarutkan dalam 2 ml
metanol. Sari air digunakan untuk percobaan berikut, 0,1 larutan percobaan
Universitas Sumatera Utara
27 dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian diuapkan di atas penangas air. Pada
sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes larutan pereaksi Molish, lalu ditambahkan dengan perlahan-lahan 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung, terbentuk
cincin ungu pada batas kedua cairan, menunjukkan adanya ikatan gula glikon
atau glikosida Depkes RI, 1995. 3.5.4 Pemeriksaan saponin
Serbuk simplisia dan ekstrak masing-masing ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas,
didinginkan, kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 menit. Jika terbentuk busa setinggi 1 - 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan buih tidak hilang
dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin Depkes RI, 1995.
3.5.5 Pemeriksaan tanin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia dan ekstrak disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna.
Diambil 2 ml larutan dan ditambahkan 1 - 2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin
Harborne, 1987.
3.5.6 Pemeriksaan steroidtriterpenoid
Serbuk simplisia dan ekstrak masing-masing ditimbang sebanyak 1 g, dimaserasi dengan 20 ml n-heksana selama 2 jam, disaring. Filtrat diuapkan dalam
cawan penguap dan pada sisanya ditambahkan pereaksi Liebermann-Burchard melalui dinding cawan. Apabila terbentuk warna ungu atau merah yang berubah
Universitas Sumatera Utara
28 menjadi biru ungu atau biru hijau menunjukkan adanya steroidtriterpenoid
Harborne, 1987.
3.6 Pembuatan Ekstrak Etanol Biji Alpukat
Serbuk simplisia diperkolasi dengan etanol, dilakukan dengan cara: Dibasahi 10 bagian simplisia atau campuran simplisia dengan derajat halus
yang cocok dengan 2,5 bagian sampai 5 bagian cairan penyari, masukkan ke dalam bejana tertutup sekurang-kurangnya selama 3 jam. Pindahkan massa sedikit
demi sedikit ke dalam perkolator sambil tiap kali ditekan hati – hati, tuangi
dengan cairan penyari secukupnya sampai cairan mulai menetes dan di atas simplisia masih terdapat cairan penyari, tutup perkolator, biarkan selama 24 jam.
Biarkan cairan menetes dengan kecepatan 1 ml per menit, tambahkan berulang- ulang cairan penyari secukupnya sehingga selalu terdapat selapis cairan penyari di
atas simplisia, hingga diperoleh 80 bagian perkolat. Peras massa, campurkan cairan perasan ke dalam perkolat, tambahkan cairan penyari secukupnya hingga
diperoleh 100 bagian. Pindahkan ke dalam bejana, tutup, biarkan selama 2 hari di tempat sejuk, terlindung dari cahaya. Enap tuangkan atau saring. Hasil perkolat
yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan dengan bantuan alat rotary evaporator
sehingga diperoleh ekstrak etanol Ditjen POM, 1979.
3.7 Pembuatan Pereaksi