Pengendapan Ammonium Sulfat dan Dialisis Ekstrak Kasar Enzim Kitinase Uji Kemampuan Daya Hambat Ekstrak Kasar Enzim Kitinase Terhadap Jamur Patogen Tanaman

ujung miselium, miselium pecah, miselium berbelah, miselium bercabang, miselium lisis, dan miselium tumbuh kerdil yang diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran maksimum.

3.7 Penentuan Kurva Pertumbuhan dan Produksi Enzim Kitinase

Isolat bakteri kitinolitik terpilih dipersiapkan kultur cairnya dengan cara diinokulasikan sebanyak dua ose ke dalam dalam 5 ml media kitin cair. Media kitin cair dibuat dengan mencampurkan 125 ml koloidal kitin 0.3, 0.65 gram Na 2 HPO 4 .2H 2 O, 1.5 gram KH 2 PO 4 , 0.25 gram NaCl, 0.5 gram NH 4 Cl, 0.12 gram MgSO 4 .7H2O dan 0.005 gram CaCl 2 dilarutkan dalam akuades hingga volume satu liter Lawati, 2013. Kultur cair digoyang dengan shaker pada suhu 37 o C selama 24 jam dengan kecepatan penggoyangan 120 rpm. Untuk penentuan kurva pertumbuhan, kultur cair diinokulasikan sebanyak 1 ml ke dalam 20 ml media kitin cair. Kultur digoyang dengan shaker pada suhu 37 o C dengan kecepatan penggoyangan 100 rpm. Setiap 24 jam dilakukan pengambilan kultur sel untuk pengukuran pertumbuhan sel dengan metode Total Plate Count TPC. Dari hasil pengukuran petumbuhan sel akan diperoleh waktu optimum untuk produksi enzim., Untuk produksi enzim kitinase kultur cair diinokulasikan sebanyak 5 ml ke dalam 100 ml media kitin cair. Kultur digoyang dengan shaker pada suhu 37 o C dengan kecepatan penggoyangan 100 rpm, lama penggoyangan dilakukan sampai pertumbuhan optimum untuk produksi enzim tercapai. Kultur kemudian disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Supernatan yang diperoleh merupakan ekstrak kasar enzim yang akan diendapkan dengan amonium sulfat Nurdebyandaru, 2008.

3.8 Pengendapan Ammonium Sulfat dan Dialisis Ekstrak Kasar Enzim Kitinase

Esktrak kasar enzim yang telah diperoleh diendapkan menggunakan ammonium sulfat dengan konsentrasi 50. Penambahan ammonium sulfat dilakukan pada suhu 4ºC dan diaduk selama 1 jam dan disentrifuse dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4ºC. Pelet yang diperoleh diresuspensi dengan buffer fosfat 0,05 M pH 7 dengan perbandingan 1:2 bv. Enzim yang telah diresuspensi dimasukkan ke dalam membran dialisis dan diinkubasi dalam buffer fosfat 0,05 M pH 7 selama 12-16 jam pada suhu 4ºC alur kerja pada Lampiran 5. Ekstrak kasar enzim kitinase yang diperoleh akan diujikan kemampuan daya hambatnya terhadap jamur patogen tanaman dengan menggunakan kertas cakram Baehaki et al., 2012.

3.9 Uji Kemampuan Daya Hambat Ekstrak Kasar Enzim Kitinase Terhadap Jamur Patogen Tanaman

Biakan jamur patogen diinokulasikan di tengah medium garam minimum kitin MGMK dengan jarak 3,5 cm dari cakram tempat inokulum bakteri, kemudian biakan tersebut diinkubasi selama 72 jam pada suhu 28-30 o C. Sebanyak 10 μ l ekstrak kasar enzim kitinase diinokulasikan pada cakram berdiameter 0,6 cm dan diletakkan di bagian tepi media. Biakan diinkubasi pada suhu ruang selama tujuh hari. Pertumbuhan jamur patogen diketahui dengan mengukur diameter zona hambat di sekitar koloni. Pengukuran pertumbuhan jamur patogen dilakukan mulai hari ke-2 inkubasi dengan metode uji antagonis bakteri kitinolitik dan jamur patogen tanaman.

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

Dari kajian uji kemampuan isolat bakteri kitinolitik Nepenthes tobaica dan Nepenthes gracilis dalam menghambat pertumbuhan beberapa jamur patogen tanaman didapatkan hasil sebagai berikut :

4.1 Peremajaan Isolat Bakteri Kitinolitik dari Nepenthes tobaica, Nepenthes

gracilis dan jamur patogen uji. Dari isolasi dan seleksi bakteri kitinolitik yang telah dilakukan sebelumnya oleh Gultom 2015 dipilih 5 isolat dengan indeks kitinolitik terbesar. Isolat terpilih yaitu CBM, KM, AM1, RH1, CBH. Isolat dapat dilihat pada Gambar 4.1.1. Gambar 4.1.1 Hasil peremajaan bakteri kitinolitik yang diisolasi dari Nepenthes spp. dengan indeks kitinolitik terbesar A CBM, B KM, C AM1, D RH1 dan E CBH pada media MGMK umur 3 hari. A B C D E