Waktu dan Tempat Alat dan Bahan Uji Antagonis Isolat Bakteri Kitinolitik Terhadap Jamur Patogen Tanaman

BAB 3 BAHAN DAN METODA

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan Mei 2014 sampai dengan Februari 2015 di Laboratorium Mikrobiologi FMIPA dan Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Medan.

3.2 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan adalah timbangan analitik, cawan petri, labu erlenmeyer, autoklaf, inkubator jamur, inkubator bakteri, spektrofotometer, shaker, sentrifuse, tabung Ependorf , gelas ukur, spatula, oven, propipet, bunsen, jarum ose bengkok, jarum ose lurus, pipet tetes, pinset, pipet serologi, tabung reaksi, rak tabung reaksi, mikroskop, handspray, cutton bud, object glass, cover glass, vortex, cork borer. Bahan yang digunakan adalah isolat bakteri kitinolitik dari Nepenthes tobaica dan Nepenthes gracilis. Bahan pendukung yang digunakan adalah aquadest, spritus, membran dialisis, alkohol 70 , alkohol 75 , buffer fosfat, kertas cakram kosong, media Nutrient Agar NA, media kitin, media Potato Dextrose Agar PDA, zat warna laktofenol. Isolat jamur patogen uji yaitu Fusarium sp. dan Rhizoctonia solani. yang diperoleh dari koleksi Laboratorium Mikrobiologi FMIPA, Universitas Sumatera Utara, Medan.

3.3 Peremajaan dan Isolat Bakteri Kitinolitik dari N. tobaica dan N. gracilis

Isolat yang digunakan dalam penelitian ini diisolasi dari Nepenthes tobaica dan Nepenthes gracilis oleh Gultom 2015. Isolat yang berasal dari Nepenthes spp. diremajakan pada media Nutrien Agar NA. Isolat hasil peremajaan dikultur pada media MGMK. Isolat yang memiliki aktivitas kitinolitik ditandai dengan zona bening di sekitar koloni alur kerja pada Lampiran 3. 3. 4 Persiapan Uji Antagonis 3.4.1 Penyiapan Jamur Patogen Uji Kultur Fusarium sp. dan Rhizoctonia solani yang digunakan dalam penelitian ini merupakan koleksi dari Laboratorium Mikrobiologi FMIPA, Universitas Sumatera Utara, Medan yang telah disubkultur ke media PDA.

3.4.2 Penyiapan Isolat Bakteri Kitinolitik

Sebanyak 3 ml NaCl 0,9 dimasukkan ke dalam masing-masing tabung reaksi secara aseptis. Isolat bakteri diinokulasikan ke dalam tabung reaksi dengan menggunakan jarum ose bengkok dan disamakan kekeruhannya dengan larutan Mc-Farland yang setara dengan konsentrasi 10 8 selml.

3.5 Uji Antagonis Isolat Bakteri Kitinolitik Terhadap Jamur Patogen Tanaman

Uji antagonis isolat bakteri kitinolotik terhadap jamur patogen tanaman dilakukan dengan dua metode. Untuk metode yang pertama biakan jamur patogen diinokulasikan di tengah medium garam minimum kitin MGMK komposisi dan metode pembuatan MGMK dapat dilihat pada Lampiran 1 dan Lampiran 2 dengan jarak 3,5 cm dari cakram tempat inokulum bakteri, biakan tersebut diinkubasi selama 72 jam pada suhu 28-30 o C. Suspensi bakteri kitinolitik sebanyak 15 μ l dengan konsentrasi ≈ 10 8 selml 0,5 standard McFarland diinokulasikan pada cakram berdiameter 0,6 cm dan diletakkan di bagian tepi media alur kerja pada Lampiran 4. Sedangkan untuk metode yang kedua biakan jamur patogen diinokulasikan di tengah medium garam minimum kitin dan tanpa proses inkubasi suspensi bakteri kitinolitik sebanyak 15 μ l dengan konsentrasi ≈ 10 8 selml 0,5 standard McFarland diinokulasikan pada cakram berdiameter 0,6 cm dan langsung diletakkan di bagian tepi media dan diinkubasi bersama. Akitivitas penghambatan ditentukan berdasarkan zona hambat yang terbentuk di sekitar koloni. Pengamatan dimulai dari hari ke-2 sampai hari ke-7 Suryanto et al., 2011. Penghambatan pertumbuhan jamur patogen oleh isolat bakteri kitinolitik Nepenthes tobaica dan Nepenthes gracilis dilakukan dengan cara mengukur batas akhir pertumbuhan dari jamur patogen pada sumbu X dan batas akhir pertumbuhan jamur patogen pada sumbu Y Gambar 3.5.1 dengan rumus : Gambar 3.5.1 Metode pengukuran zona hambat bakteri kitinolitik terhadap koloni jamur patogen: A. Koloni jamur; B. Zona hambat bakteri kitinolitik; C. Titik tengah jamur diletakkan; D. Koloni bakteri kitinolitik; X. Diameter koloni jamur yang terhambat pertumbuhannya; Y. Diameter koloni jamur normal Dari hasil pengukuran akan diperoleh isolat bakteri kitinolitik dengan indeks kitinolitik tertinggi akan digunakan untuk produksi enzim kitinase.

3.6 Pengamatan Struktur Hifa Abnormal