akhir pertumbuhan dari jamur patogen pada sumbu X dan batas akhir pertumbuhan jamur patogen pada sumbu Y Gambar 3.5.1 dengan rumus :
Gambar 3.5.1 Metode pengukuran zona hambat bakteri kitinolitik terhadap koloni jamur patogen: A. Koloni jamur; B. Zona hambat
bakteri kitinolitik; C. Titik tengah jamur diletakkan; D. Koloni bakteri kitinolitik; X. Diameter koloni jamur yang
terhambat pertumbuhannya; Y. Diameter koloni jamur normal
Dari hasil pengukuran akan diperoleh isolat bakteri kitinolitik dengan indeks kitinolitik tertinggi akan digunakan untuk produksi enzim kitinase.
3.6 Pengamatan Struktur Hifa Abnormal
Pengamatan struktur hifa secara mikroskopis dilakukan untuk melihat
abnormalitas struktur hifa jamur patogen dari uji antagonis bakteri kitinolitik. Pengamatan dilakukan dengan cara mengamati ujung miselium pada daerah zona
hambat fungi patogen. Ujung miselium jamur patogen yang tumbuh pada permukaan media dipotong dengan bentuk bujur sangkar, diletakkan pada gelas
objek dan ditambahkan laktofenol untuk memperjelas penampakan struktur hifa. Struktur hifa yang tampak dibandingkan dengan struktur hifa normal.
Abnormalitas pada pertumbuhan miselium fungi patogen seperti, pembengkokan
ujung miselium, miselium pecah, miselium berbelah, miselium bercabang, miselium lisis, dan miselium tumbuh kerdil yang diamati di bawah mikroskop
dengan perbesaran maksimum.
3.7 Penentuan Kurva Pertumbuhan dan Produksi Enzim Kitinase
Isolat bakteri kitinolitik terpilih dipersiapkan kultur cairnya dengan cara diinokulasikan sebanyak dua ose ke dalam dalam 5 ml media kitin cair. Media
kitin cair dibuat dengan mencampurkan 125 ml koloidal kitin 0.3, 0.65 gram Na
2
HPO
4
.2H
2
O, 1.5 gram KH
2
PO
4
, 0.25 gram NaCl, 0.5 gram NH
4
Cl, 0.12 gram MgSO
4
.7H2O dan 0.005 gram CaCl
2
dilarutkan dalam akuades hingga volume satu liter Lawati, 2013. Kultur cair digoyang dengan shaker pada suhu 37
o
C selama 24 jam dengan kecepatan penggoyangan 120 rpm. Untuk penentuan kurva
pertumbuhan, kultur cair diinokulasikan sebanyak 1 ml ke dalam 20 ml media kitin cair. Kultur digoyang dengan shaker pada suhu 37
o
C dengan kecepatan penggoyangan 100 rpm. Setiap 24 jam dilakukan pengambilan kultur sel untuk
pengukuran pertumbuhan sel dengan metode Total Plate Count TPC. Dari hasil pengukuran petumbuhan sel akan diperoleh waktu optimum untuk produksi
enzim., Untuk produksi enzim kitinase kultur cair diinokulasikan sebanyak 5 ml ke
dalam 100 ml media kitin cair. Kultur digoyang dengan shaker pada suhu 37
o
C dengan kecepatan penggoyangan 100 rpm, lama penggoyangan dilakukan sampai
pertumbuhan optimum untuk produksi enzim tercapai. Kultur kemudian disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Supernatan yang
diperoleh merupakan ekstrak kasar enzim yang akan diendapkan dengan amonium sulfat Nurdebyandaru, 2008.
3.8 Pengendapan Ammonium Sulfat dan Dialisis Ekstrak Kasar Enzim Kitinase
