susu skim, sebanyak 1 ml sampel di encerkan dalam BPW dengan berbagai seri pengenceran kemudian diplating metode tuang ke dalam media TSAYE secara
duplo dan diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 48 jam. Proses pengeringan semprot dilakukan dalam skala laboratorium, suhu udara
inlet yang digunakan 160 ºC dan suhu udara outlet ±82 ºC didapatkan dengan mengatur flow rate selama skim milk dimasukkan Permadi 2010. Sampel susu
bubuk kering ditampung dalam botol steril yang tertutup rapat, diaduk dengan spatula steril dan disimpan pada suhu 4 ºC Ling et al. 2010.
c. Sintas Cronobacter sp.
setelah Pengeringan Semprot
Penghitungan viabilitas mikroorganisme dilakukan dengan memplating pada media TSAYE media TSA yang suplementasi 0.6 yeast extract sebagai
recovery media secara duplo kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 48 jam Arroyo et al. 2009. Perhitungan logaritmik penurunan jumlah bakteri
dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Keterangan: S = penurunan jumlah koloni
N = Jumlah populasi mikroba sebelum proses termal
N
t
= Jumlah mikroba setelah proses termal Jumlah koloni sebelum dan setelah pengeringan hasil perhitungan pada
media TSAYE yang diketahui dalam CFUml dikonversi dalam CFUg untuk mengetahui jumlah Cronobacter sp. terpilih dalam susu skim bubuk kering.
d. Analisis Perubahan Sintas Cronobacter sp. dalam Susu Skim Bubuk
Hasil Pengeringan Semprot Saat Rekonstitusi Suhu 27 °C dan 50 °C
Uji pengaruh rekonstitusi terhadap sintas Cronobacter sp. dalam susu
bubuk skim hasil pengeringan semprot dilakukan dengan merekonstitusi sebanyak 2,2 gram sampel susu bubuk skim dengan menggunakan 15 ml akuades steril
yang bersuhu kamar 27 °C dan suhu 50 °C sekitar 1 menit. Jumlah Cronobacter sp.
langsung dihitung dengan memplating pada medium TSAYE dan bentuk koloni yang tumbuh diamati. Dari sampel hasil rekonstitusi juga diamati
N N
t
___ ___
Log S
=
morfologi sel Cronobacter sp. setelah mengalami proses pengeringan semprot
dengan mikroskop cahaya dan mikroskop polarisasi
3.6.5 Pengaruh Penyimpanan pada RH Berbeda terhadap Sintas
Cronobacter sp.
Produk susu bubuk hasil pengeringan semprot disimpan pada desikator yang telah diatur kondisi RH nya pada RH 50, 70 dan 90 dalam desikator yang
telah diatur kelembapannya menggunakan K
2
CO
3
RH ±50, NaNO
3 2
RH ± 70 dan BaCl
2
RH±90. Penyimpanan dilakukan selama 3 bulan dan pengujian sampel dilakukan setiap 1 minggu.
Analisis yang dilakukan pada susu bubuk skim selama penyimpanan meliputi viabilitas, perubahan a
w
dan kadar air susu bubuk, sedangkan analisis setelah merekonstitusi susu bubuk dengan air steril suhu kamar 27°C dan suhu
50°C meliputi : jumlah Cronobacter sp., penurunan logaritma populasi sel, morfologi sel serta bentuk koloni pada media TSAYE.
3.6.6 Pembuatan Kurva Perubahan Cronobacter sp. selama Penyimpanan
dan Saat Rekonstitusi
Jumlah Cronobacter sp. selama penyimpanan dan saat rekonstitusi di dikonversi menjadi nilai log dan diplotkan pada kurva semilog dengan sumbu y
menunjukkan koloni yang masih hidup setelah penyimpanan atau saat rekonstitusi log CFU dan sumbu x menunjukkan interval waktu dalam minggu berdasarkan
RH penyimpanan yang diujikan. Kinetika inaktivasipertumbuhan mikroba selama penyimpanan pada RH konstan mengikuti reaksi ordo 1, dengan persamaan
sebagai berikut :
Keterangan: N
= jumlah bakteri yang hidup - k = konstanta laju reaksi konstanta laju perubahan jumlah bakteri
Untuk mengetahui laju pertumbuhankematian Cronobacter sp. selama penyimpanan pada berbagai RH RH 50, 70, dan 90, data jumlah bakteri
dan lama penyimpanan dibuat kurva plot antara log jumlah mikroba setiap minggu
dengan jumlah mikroba awal log NtNo pada sumbu y dan dan sumbu x menunjukkan interval waktu dalam minggu. Selanjutnya dilakukan perhitungan
nilai K dari slope kurva y= -kt2,303, K merupakan waktu dalam minggu yang dibutuhkan untuk meningkatkanmenurunkan jumlah Cronobacter sp. sebesar 1
siklus log. Slope kurva didapatkan dengan menggunakan persamaan dibawah ini :
Nilai slope 2,303k , dinyatakan sebagai K waktu penurunan desimal, sehingga :
Keterangan: Nt
= jumlah bakteri setelah penyimpanan t minggu N
= jumlah awal bakteri t = slopekemiringan yang menunjukkan konstanta laju reaksi
konstanta laju perubahan jumlah bakteri Hariyadi 2010
Metode Analisis a.
Pengamatan Morfologis dengan Pewarnaan Gram Fardiaz 1987
Sebanyak 1 lup penuh air steril diletakkan pada kaca objek, kemudian dengan jarum ose steril dipindahkan sedikit isolatsampel ke atasnya selanjutnya
dicampurkan dan disebarkan hingga merata dan dibiarkan mengering. Kaca objek dilewatkan di atas api bunsen sampai kaca objek terasa agak panas dan sesekali
dikeringkan di udara sehingga terbentuk lapisan kultur yang tipis dan merata. Pewarnaan gram dimulai dengan meneteskan pewarna primer kristal violet secara
merata di atas kultur pada kaca objek dan dibiarkan selama 1 menit. Selanjutnya kaca objek dimiringkan untuk membuang kelebihan kristal violet lalu dibilas
dengan air dari botol semprot, sisa air diserap dengan menggunakan kertas serap.
Kemudian kultur ditetesi dengan Iugol dan dibiarkan selama 2 menit, dimiringkan dan selanjutnya dibilas dengan air, sisa warna yang masih ada dihilangkan dengan
pemucat warna ethanol 95, tetes demi tetes selama 10-20 detik sampai zat warna kristal tidak terlihat lagi mengalir dari kaca objek. Cuci kembali kaca objek
dengan air mengalir lalu ditiriskan an selanjutnya ditetesi dengan larutan safranin selama 10-20 detik. Kaca objek kemudian dimiringkan dan kembali dibilas
dengan air, tiriskan dan sisa air yang masih ada diserap dengan kertas serap. Selanjutnya preparat siap untuk diamati dibawah mikroskop.
Pengamatan dengan mikroskop binokuler dan polarisasi dilakukan dengan menggunakan lensa objektif minyak emersi 1000 x dimulai dari pembesaran
terendah dan berangsur-angsur diganti dengan pembesaran yang tinggi. Pengamatan dilakukan terhadap ukuran, bentuk dan cara pengelompokan tunggal,
berpasangan, rantai, bergerombol, dan sebagainya. Reaksi gram positif ditandai dengan warna sel ungu atau biru, sedangkan gram negatif berwarna merah muda.
Berdasarkan keterangan sebelumnya, diketahui bahwa E. sakazakii merupakan bakteri gram negatif berbentuk batang.
b. Konfirmasi Isolat Cronobacter spp.
Konfirmasi isolat Cronobacter spp. dilakukan dengan menggoreskan 1 ose
kultur dari agar miring TSA atau 1 ose kultur yang telah disegarkan dalam media BHI ke media DFI, kemudian menginkubasinya pada suhu 37 ºC selama 24 jam.
Koloni yang positif Cronobacter spp.
pada media
DFI berwarna biru kehijauan, satu koloni terpisah yang tumbuh pada media DFI diambil 1 ose kemudian digores
pada media TSA miring, koloni positif pada media TSA berwarna kuning.
c. Penghitungan Populasi dari Cronobacter spp.
Untuk menghitung populasi Cronobacter spp., sampel dibuat seri pengenceran dalam media BPW Buffered Peptone Water . Sebanyak 1 ml
sampel hasil pengenceran diplating dengan metode tuang pada media TSAYE dan koloni dihitung setelah 48 jam inkubasi pada suhu 37
o
C. Total populasi Cronobacter spp.
dihitung berdasarkan rumus dari BAM Bacteriological Analytical Manual berikut ini :
N =
dimana ; N = jumlah koloni per mlgram
C = jumlah koloni dari tiap –tiap petri
n
1
= jumlah petri dari pengenceran pertama yang dihitung n
2
= jumlah petri dari pengenceran kedua d = pengenceran pertama yang dihitung
d. Kadar Air
