dengan menginokulasikan satu ose koloni secara aseptik ke dalam BHI steril dan menginkubasinya pada suhu 37 ºC selama 24 jam.
b. Rekonfirmasi Isolat Cronobacter spp.
Kultur Cronobacter spp. yang telah disegarkan DES b7a, DES b10, DES
c13 DES d3, YR t2a, YR c3a, E-6 dan ATCC 51329 dikonfirmasikan terlebih dahulu untuk mengetahui kemurnian kultur yang digunakan. Konfirmasi meliputi
pewarnaan Gram dan warna koloni pada media DFI serta TSA.
c. Perhitungan Jumlah Cronobacter spp.
Isolat Cronobacter spp. yang disimpan pada media TSA miring diaktivasi
dengan menginokulasikan satu ose koloni secara aseptik ke dalam 10 ml BHI steril dan menginkubasinya pada suhu 37 ºC selama 16-17 jam sampai fase akhir
log sehingga didapatkan kultur dengan populasi sel sekitar 10
8
-10
9
CFUml Permadi 2010. Untuk mendapatkan kultur dengan populasi sel sekitar 10
6
-10
7
CFUml yang digunakan dalam skrining cepat ketahanan panas, sebanyak 1 ml kultur yang telah ditumbuhkan dalam media BHI diencerkan sedemikian rupa
dalam 9 ml TSB steril.
3.6.2 Skrining Cepat Ketahanan Panas Isolat Cronobacter spp.
pada Suhu 50 °C selama 30 menit pada Medium TSB Modifikasi Iversen 2003.
Skrining dilakukan sebagai tahap awal untuk memilih Cronobacter spp. yang paling tahan terhadap suhu 50 °C
selama 30’. Isolat Cronobacter spp. yang
paling tahan suhu 50 °C nantinya akan diuji ketahanan terhadap proses pengeringan dan kondisi kekeringan. Sebanyak 1 ml dari masing-masing kultur
Cronobacter spp. hasil aktivasi pada langkah 3 jumlah awal inokulum sekitar 10
6
-10
7
CFUml diinokulasikan ke dalam 9 ml TSB steril sebagai media pemanas, media tersebut terlebih dahulu dipanaskan dalam waterbath shaker
hingga suhunya mencapai 50
o
C. Suhu campuran TSB + inokulum dipertahankan selama 30 menit. Untuk memonitor suhu media pemanas selama
pemanasan berlangsung, 1 tabung TSB kontrol dilengkapi dengan termometer. Setelah proses pemanasan, tabung yang berisi campuran TSB +
inokulum dengan
cepat dipindahkan
ke dalam
tempat yang
berisi air deionisasi dan es yang telah dihancurkan untuk menghentikan proses
pemanasan. Untuk mencapai suhu sampel 0 C dapat dilakukan pendinginan dalam waktu 5-6 menit, suhu target umumnya dicapai dalam 2 menit. Setelah
sampel mencapai 0 C, dilakukan langkah resusitasi pada suhu ruang sekitar 27 C dalam rentang waktu maksimal 60 menit Lang Smith 2008. Pada
penelitian ini langkah resusitasi dilakukan selama 30-40 menit. Selanjutnya sebanyak 1 ml campuran TSB+inokulum dipipet dan kedalam 9 ml BPW steril
untuk dilakukan serial pengenceran hingga 10
-4
diasumsikan terjadi penurunan populasi sel sebesar 2-3 siklus log Tiga pengenceran terakhir dilakukan
pencawanan dengan metode tuang. Jumlah koloni awal dihitung dengan melakukan serial pengenceran kultur
pada TSB hingga 10
-5
dengan menggunakan pengencer BPW steril. Tiga pengenceran terakhir masing-masing dilakukan pencawanan dengan metode
tuang. Selisih log10 antara jumlah koloni awal dan jumlah koloni setelah perlakukan merupakan besar penurunan jumlah koloni. Satu isolat dengan
ketahanan panas tertinggi penurunan log10 terkecil dipilih untuk diuji ketahanannya selama proses pengeringan semprot dan penyimpanan pada RH
berbeda.
3.6.3 Sintas Isolat Cronobacter sp. Terpilih Sebelum Proses Pengeringan
