dengan menginokulasikan satu ose koloni secara aseptik ke dalam BHI steril dan menginkubasinya pada suhu 37 ºC selama 24 jam.
b. Rekonfirmasi Isolat Cronobacter spp.
Kultur Cronobacter spp. yang telah disegarkan DES b7a, DES b10, DES
c13 DES d3, YR t2a, YR c3a, E-6 dan ATCC 51329 dikonfirmasikan terlebih dahulu untuk mengetahui kemurnian kultur yang digunakan. Konfirmasi meliputi
pewarnaan Gram dan warna koloni pada media DFI serta TSA.
c. Perhitungan Jumlah Cronobacter spp.
Isolat Cronobacter spp. yang disimpan pada media TSA miring diaktivasi
dengan menginokulasikan satu ose koloni secara aseptik ke dalam 10 ml BHI steril dan menginkubasinya pada suhu 37 ºC selama 16-17 jam sampai fase akhir
log sehingga didapatkan kultur dengan populasi sel sekitar 10
8
-10
9
CFUml Permadi 2010. Untuk mendapatkan kultur dengan populasi sel sekitar 10
6
-10
7
CFUml yang digunakan dalam skrining cepat ketahanan panas, sebanyak 1 ml kultur yang telah ditumbuhkan dalam media BHI diencerkan sedemikian rupa
dalam 9 ml TSB steril.
3.6.2 Skrining Cepat Ketahanan Panas Isolat Cronobacter spp.
pada Suhu 50 °C selama 30 menit pada Medium TSB Modifikasi Iversen 2003.
Skrining dilakukan sebagai tahap awal untuk memilih Cronobacter spp. yang paling tahan terhadap suhu 50 °C
selama 30’. Isolat Cronobacter spp. yang
paling tahan suhu 50 °C nantinya akan diuji ketahanan terhadap proses pengeringan dan kondisi kekeringan. Sebanyak 1 ml dari masing-masing kultur
Cronobacter spp. hasil aktivasi pada langkah 3 jumlah awal inokulum sekitar 10
6
-10
7
CFUml diinokulasikan ke dalam 9 ml TSB steril sebagai media pemanas, media tersebut terlebih dahulu dipanaskan dalam waterbath shaker
hingga suhunya mencapai 50
o
C. Suhu campuran TSB + inokulum dipertahankan selama 30 menit. Untuk memonitor suhu media pemanas selama
pemanasan berlangsung, 1 tabung TSB kontrol dilengkapi dengan termometer. Setelah proses pemanasan, tabung yang berisi campuran TSB +
inokulum dengan
cepat dipindahkan
ke dalam
tempat yang
berisi air deionisasi dan es yang telah dihancurkan untuk menghentikan proses
pemanasan. Untuk mencapai suhu sampel 0 C dapat dilakukan pendinginan dalam waktu 5-6 menit, suhu target umumnya dicapai dalam 2 menit. Setelah
sampel mencapai 0 C, dilakukan langkah resusitasi pada suhu ruang sekitar 27 C dalam rentang waktu maksimal 60 menit Lang Smith 2008. Pada
penelitian ini langkah resusitasi dilakukan selama 30-40 menit. Selanjutnya sebanyak 1 ml campuran TSB+inokulum dipipet dan kedalam 9 ml BPW steril
untuk dilakukan serial pengenceran hingga 10
-4
diasumsikan terjadi penurunan populasi sel sebesar 2-3 siklus log Tiga pengenceran terakhir dilakukan
pencawanan dengan metode tuang. Jumlah koloni awal dihitung dengan melakukan serial pengenceran kultur
pada TSB hingga 10
-5
dengan menggunakan pengencer BPW steril. Tiga pengenceran terakhir masing-masing dilakukan pencawanan dengan metode
tuang. Selisih log10 antara jumlah koloni awal dan jumlah koloni setelah perlakukan merupakan besar penurunan jumlah koloni. Satu isolat dengan
ketahanan panas tertinggi penurunan log10 terkecil dipilih untuk diuji ketahanannya selama proses pengeringan semprot dan penyimpanan pada RH
berbeda.
3.6.3 Sintas Isolat Cronobacter sp. Terpilih Sebelum Proses Pengeringan
Semprot dalam Susu Skim Saat Rekonstitusi Suhu 27 °C dan 50 °C
a. Inokulasi Isolat Cronobacter sp.
Terpilih dalam Susu Skim dengan Air Bersuhu 27°C dan 50 °C
Satu isolat terpilih ditumbuhkan pada BHI steril kemudian diinkubasi sampai akhir fase log pada inkubator 37
o
C 16-17 jam sehingga didapatkan jumlah kerapatan sel sekitar 10
8
-10
9
CFUml. Uji pengaruh suhu rekonstitusi terhadap sintas Cronobacter sp.
dilakukan dengan menginokulasikan 1 ml kultur Cronobacter sp.
ke dalam susu skim bubuk yang telah ditimbang sesuai takaran saji susu formula yaitu 2,2 gram dalam 15 ml air 13,2 gram dalam 90 ml air.
Susu skim bubuk yang telah diinokulasi dengan Cronobacter sp. selanjutnya
direkonstitusi menggunakan dua suhu air steril yaitu 27
o
C air suhu kamar dan 50
o
C. Populasi sel hasil rekonstitusi suhu ±27
o
C diasumsikan sebagai jumlah awal sel Cronobacter sp., suhu 27 °C merupakan range suhu pertumbuhan
Cronobacter spp. suhu optimum pertumbuhan 25 ºC sampai 45 ºC sehingga
pada suhu ini dianggap tidak ada penurunan populasi Cronobacter sp. .Susu skim
hasil rekonstitusi kemudian dilakukan pemupukan secara duplo pada media TSAYE untuk mengetahui jumlah Cronobacter sp.
setelah direkonstitusi air suhu kamar 27 °C dan 50
o
C.
b. Pengamatan Morfologi Sel
Cronobacter sp. dalam sampel susu yang telah direkonstitusi dengan air
bersuhu kamar 27 °C dan 50
o
C diamati morfologi selnya dengan menggunakan mikroskop cahaya dan mikroskop polarisasi serta bentuk koloni yang tumbuh pada
media TSAYE.
3.6.4 Pengujian Pengaruh Proses Pengeringan Semprot dalam Medium
Susu Skim 40 wv terhadap Sintas Cronobacter sp.
Terpilih a.
Persiapan Kultur Cronobacter sp. untuk Proses Pengeringan Semprot
Persiapan inokulum bertujuan untuk mendapatkan biomassa sel maksimal, umumnya biomassa sel dihasilkan maksimal pada fase akhir lag atau saat awal
fase stationer. Sebanyak 1 ose isolat Cronobacter sp. diinokulasikan dalam 100
BHI steril dan diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 16-17 jam, selanjutnya dilakukan pemanenan massa sel dengan cara melakukan sentrifugasi 45 ml kultur
pada 3000 rpm selama 15 menit, pellet hasil sentrifugasi diresuspensikan ke dalam 2-3 ml BPW steril kultur stok. Untuk menghitung jumlah mikroba awal,
sebanyak 1 ml kultur di encerkan dalam BPW dengan berbagai seri pengenceran kemudian diplating metode tuang ke dalam media TSAYE secara duplo dan
diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 48 jam.
b. Proses Pengeringan Semprot
Pellet hasil pemanenan yang telah diketahui jumlahnya dengan populasi awal sekitar 10
10
– 10
11
CFUg yang diperoleh dari tahap diatas inokulasikan ke dalam 450 ml 40 wv susu skim Ling et al. 2010 yang telah disterilisasi pada
suhu 100°C selama 15 menit. Setelah itu susu skim rekonstitusi yang telah diinokulasi divortek selama 10 menit dan selanjutnya dikeringkan dengan
pengering semprot. Untuk menghitung jumlah mikroba dalam 450 ml 40 wv
susu skim, sebanyak 1 ml sampel di encerkan dalam BPW dengan berbagai seri pengenceran kemudian diplating metode tuang ke dalam media TSAYE secara
duplo dan diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 48 jam. Proses pengeringan semprot dilakukan dalam skala laboratorium, suhu udara
inlet yang digunakan 160 ºC dan suhu udara outlet ±82 ºC didapatkan dengan mengatur flow rate selama skim milk dimasukkan Permadi 2010. Sampel susu
bubuk kering ditampung dalam botol steril yang tertutup rapat, diaduk dengan spatula steril dan disimpan pada suhu 4 ºC Ling et al. 2010.
c. Sintas Cronobacter sp.
