Pisahkan lapisan benzen, saring, filtrat berwarna kuning, menunjukkan adanya antrakinon. Kocok lapisan benzena dengan 1-2 ml natrium hidroksida 2N,
diamkan, lapisan air berwarna merah dan lapisan benzena tidak berwarna menunjukkan adanya antrakinon Depkes RI, 1995.
3.8.6 Pemeriksaan tanin
Sebanyak 0,5 g sampel disari dengan 10 ml air suling, disaring lalu filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Diambil 2 ml
larutan lalu ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi besi III klorida. Terjadi warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin Depkes RI, 1979.
3.8.7 Pemeriksaan steroid triterpenoid
Sebanyak 1 g sampel dimaserasi dengan n-heksan selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa ditambahkan 2 tetes
asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat. Timbul warna biru atau hijau menunjukkan adanya steroid dan timbul warna merah, pink atau ungu
menunjukkan adanya triterpenoid Farnsworth, 1966.
3.9 Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Jarak Pagar
Serbuk simplisia diekstraksi dengan cara maserasi dengan menggunakan pelarut etanol 70.
Menurut Farmakope Indonesia Edisi III 1979, caranya adalah sebagai berikut:Sebanyak 1600 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam sebuah bejana,
dituangi dengan 75 bagian etanol 12 liter, ditutup, dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil sering diaduk, diserkai, diperas. Ampas
diremaserasi dengan 4 liter etanol hingga diperoleh 100 bagian. Dipindahkan
Universitas Sumatera Utara
ke dalam bejana tertutup, dibiarkan di tempat sejuk terlindung dari cahaya selama 2 hari. Dienap tuangkan atau disaring. Pemekatan ekstrak dilakukan
dengan alat rotary evaporator pada suhu 40°C, selanjutnya diuapkan di waterbath pada suhu 70-75°C sampai diperoleh ekstrak kental.
3.10 Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol Daun Jarak Pagar
Skrining fitokimia ekstrak etanol daun jarak pagar meliputi pemeriksaan senyawa alkaloid, glikosida, saponin, flavonoid, antrakinon, tanin
dan steroidtriterpenoid Depkes RI, 1995; Farnsworth, 1966. Prosedur pemeriksaan ekstrak etanol daun jarak pagar sama seperti prosedur skrining
fitokimia terhadap simplisia daun jarak pagar.
3.11 Pembuatan Media Untuk Bakteri Uji
3.11.1 Nutrient agar
Komposisi: Lab-Lemco powder
1,0 g Yeast exstract
2,0 g Peptone
5,0 g Sodium chloride
5,0 g Agar
15,0 g Cara pembuatan:
Sebanyak 28 g nutrient agar dilarutkan dalam air suling steril ad 1000 ml kemudian dipanaskan hingga semua larut, dalam keadaan panas larutan
tersebut kemudian dimasukkan dalam erlenmeyer, lalu disterilkan di autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit Oxoid, 2013.
Universitas Sumatera Utara
3.11.2 Nutrient broth
Komposisi: Lab-Lamco powder 1,0 g
Yeast extract 2,0 g
Bacto peptone 5,0
g Sodium chloride
5,0 g
Cara pembuatan: Sebanyak 13 g nutrient broth dilarutkan dalam air suling steril ad 1000
ml kemudian dipanaskan hingga semua larut, dalam keadaan panas larutan tersebut kemudian dimasukkan dalam Erlenmeyer, lalu disterilkan di autoklaf
pada suhu 121°C selama 15 menit Oxoid, 2013.
3.11.3 Pembuatan suspensi standar Mc.Farland
Suspensi standar yang menunjukkan konsentrasi kekeruhan suspensi bakteri sama dengan 10
8
CFUml. Komposisi:
Larutan asam sulfat 1 99,5 ml
Larutan barium klorida 1,175 bv 0,5 ml Cara pembuatan:
Larutan keduanyadicampurkan dalam tabung reaksi steril, dikocok sampai homogen dan ditutup. Apabila kekeruhan hasil suspensi bakteri sama
dengan kekeruhan suspensi standar berarti konsentrasi bakteri 10
8
CFUml Vandepitte, 1991
3.11.4 Pembuatan agar miring
Tabung reaksi yang steril ke dalamnya dimasukkan 3 ml media nutrient agar steril, didiamkan pada temperatur kamar sampai sediaan membeku pada
Universitas Sumatera Utara
posisi miring membentuk sudut 45
o
, kemudian disimpan dalam lemari pendingin.
3.12 Penyiapan Inokulum
3.12.1 Pembuatan stok kultur bakteri uji
Cara kerja: Biakan bakteri Pseudomonas aeruginosa dari strain utama diambil
dengan jarum ose steril, diinokulasikan pada permukaan media nutrient agar miring, kemudian diinkubasikan pada suhu 35±2
o
C selama 24 jam, dengan cara yang sama dibuat stok kultur bakteri Staphylococcus aureus dan
Staphylococcus epidermidis.
3.12.2 Pembuatan inokulum bakteri uji
Cara kerja: Koloni bakteri Pseudomonas aeruginosa diambil dari stok kultur
menggunakan jarum ose steril, disuspensikan ke dalam 10 ml larutan Nutrient Broth NB steril, dihomogenkan lalu diinkubasikan pada suhu 35±2
o
C sampai diperoleh kekeruhan yang sama dengan kekeruhan standart Mc.Farland, berarti
konsentrasi bakteri adalah 10
8
CFUml. Dilakukan pengenceran dengan memipet 0,1 ml biakan bakteri 10
8
CFUml, dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril yang berisi larutan Nutrient Broth NB sebanyak 9,9 ml dan
dikocok sampai homogen, sehingga diperoleh suspensi bakteri dengan konsentrasi 10
6
CFUml dan dengan cara yang sama dibuat inokulum bakteri Staphylococcus aureus dan Staphylococcus epidermidis.
Universitas Sumatera Utara
3.13 Sterilisasi Alat Dan Bahan
Sterilisasi alat-alat non gelas digunakan metode sterilisasi panas basah menggunakan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit dan sterilisai alat-alat
gelas digunakan metode sterilisasi panas kering menggunakan oven suhu 160- 170°C selama 2 jam. Jarum ose dibakar dengan api Bunsen Pratiwi, 2008.
3.14 Pembuatan Larutan Uji Ekstrak Etanol Daun Jarak Pagar
Sebanyak 2,5 g ekstrak etanol daun jarak pagar ditimbang, kemudian ditambahkan DMSO Dimetyl Sulfoxide hingga volume total 5 ml, diaduk
hingga larut dan diperoleh konsentrasi 500 mgml, kemudian dibuat pengenceran 400, 300, 250, 200, 150 dan 100 mgml dan dimasukkan ke dalam
vial, masing-masing vial diberi label.
3.15 Pengujian Aktivitas Antibakteri Terhadap Ekstrak Etanol Daun
