Lokasi dan Waktu Penelitian Metode Penelitian Penyiapan Konjugasi p-SCN-Bz-

22 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan dari bulan Februari hingga Juni 2014 di Laboratorium Pusat Teknologi Radioisotop dan Radiofarma PTRR, Badan Tenaga Nuklir Nasional BATAN, Gd. 11, Kawasan PUSPIPTEK, Serpong, Kota Tangerang Selatan.

3.2. Metode Penelitian

Penelitian ini dilakukan secara eksperimental. Metodologi penelitian meliputi fragmentasi antibodi monoklonal nimotuzumab, pengikatan bifunctional chelating agent BFCA p-benzyl isothiocyanate- 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid p-SCN-Bz- DOTA pada fra gmen Fab’ 2 -nimotuzumab, penandaan p-SCN-Bz- DOTA- fragmen Fab’ 2 -nimotuzumab dengan 177 Lu yang kemudian diikuti dengan pemurnian dan uji stabilitas 177 Lu-p-SCN-Bz-DOTA- fragmen Fab’ 2 -nimotuzumab.

3.3. Alat dan Bahan

3.3.1 Alat

Magnetic stirer Labcompanion, Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT Shimadzu VP Series Means yang terdiri dari system controller SCL-10A vp, HPLC pump LC-10AD vp, solvent selector FCV 10AL vp, detektor UV-Vis SPD-10A vp,dan size exclusion column SEC, Aglient Bio SEC-3, 7,8 x 300 mm, thermomixer Eppendrof, termometer, water bath, Mini-PROTEAN Tetra Cell Electrophoresis Bio-Rad, Scanner HP Photosmart C4780, orbital shaker Fisher Scientific, plate reader Biotek, mikropipet, labu ukur, bakker glass, statif, kolom 10 x 1,2 cm Bio-Rad, neraca analitik Satorius, BSA3235-CW, max. 320 g, neraca analitik Denver, 210 g- UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 0,001 g, spatula, batang pengaduk, pipet tetes, sentrifus Hettich EBA 8 S dose calibrator, rotor, dan sentrifus berpendingin Alegra 64 R.

3.3.2 Bahan

Nimotuzumab Innogene, Kalbe Tech, HCl, NaOH, Lu-177 177 LuCl 3 diperoleh dengan cara mengirradiasi 176 Lu 176 Lu 2 O 3 , pengkayaan 39,60, Isoflex, di RSG-GAS yang kemudian diproses di laboratorium PTRR, bovine serum albumin BSA, Sigma, resin penukar ion Chelex 100 Bio-Rad, NaCl, asam asetat glasial, natrium asetat, dipotasium hidrogen fosfat, metanol, potasium dihidrogen fosfat, sodium dodecyl sulfat SDS 10, pewarna protein Bio-Rad, p-SCN-Bz-DOTA, larutan pewarna Coomasie Blue G-250 Bio-Rad, pepsin serbuk Sigma, Trizma base, air bebas ion hambatan 18,2 MegaOhm, EDTA E.Merck, N,N,N’N’-tetramethylenthylenediamine TEMED, ammonium peroxide disulfate APS, amonium asetat, protein filter 10.000 MWCO, 5ml, Viva Science, bromophenol blue , -merkaptoetanol, gliserol, phosphate buffered salin PBS, Mini-PROTEAN TGX 4-20 Bio-Rad, N’N’-bis- methylene-acrylamide, celex Bio-Rad, akrilamid, Sephadex G-25, PD-10 dan glisin.

3.4 Fragmentasi Nimotuzumab

3.4.1 Pemurnian Nimotuzumab

Nimotuzumab dimurnikan dari zat tambahan lainnya dengan cara dialisis. Sejumlah nimotuzumab 12,5 mg, 2,5 mL dimasukkan kedalam kaset dialisis 20 KD MWCO dan kemudian didialisis dalam 0,02 M dapar asetat pH 4,5 pada suhu 4 C selama 72 jam dengan penggantian dapar setiap 24 jam. Nimotuzumab hasil dialisis diukur konsentrasinya menggunakan spektofotometri UV-Vis dan dianalisis lebih lanjut dengan KCKT Humani, Ramli, Rustendi, Subur, 2010. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.4.2 Fragmentasi Nimotuzumab Menjadi Fab’2

0,625 mg pepsin 3200 Umg ditambahkan ke dalam 2,5 mL larutan nimotuzumab 5mgmL dengan perbandingan 1:4 mgmL. Campuran diinkubasi dengan Thermomixer pada 300 rpm selama 14 jam pada suhu 37 C. Proses fragmentasi kemudian dihentikan dengan penambahan 3,75 mL tris-HCl pH 8,0. Campuran siap untuk proses pemurnian Haryuni, et al., 2014.

3.4.3 Pemurnian Fab’

2 -Nimotuzumab Fragment Fab’ 2 -nimotuzumab dipisahkan dari fragmen Fc dengan menggunakan kolom PD-10 di pre-blocked dengan bovine serum albumin dan pre-equilibrated dengan dapar fosfat 0,01 M pH 7,4. Sejumlah 0,5 µL campuran hasil fragmentasi dimasukan ke bagian atas kolom yang diikuti dengan proses fraksinasi dengan eluen dapar fosfat 0,01 M pH 7,4. Eluat kemudian ditampung dalam tabung mikro 20 tabung, 0,25 mL tabung. Sejumlah cuplikan 10 µL kemudian diambil dari setiap fraksi dan dimasukkan kedalam 96 micro well. Ke dalam setiap cuplikan ini kemudian ditambahkan 90 µL pewarna protein BioRad, ¼ vv dalam H 2 O yang dilanjutkan dengan pengamatan perubahan warna absorbansi untuk melihat keberadaan protein hasil fraksinasi. Fraksi-fraksi yang memberikan warna biru absorbansi kemudian dianalisis lebih lanjut dengan KCKT dan SDS-PAGE non-pereduksi dan pereduksi Haryuni, et al., 2014.

3.4.4 Analisis Fab’

2 -Nimotuzumab Menggunakan KCKT Analisis Fab’ 2 -nimotuzumab menggunakan perangkat KCKT Shimadzu yang dilengkapi dengan size exclusion column SEC, Bio-SEC S250,7,7 x 300 mm dan detektor UV-Vis 280 nm. Kolom kemudian dielusi secara isokratik dengan 0,01 M PBS pH 7,4 laju alir 1mLmenit Hermanto, Haryuni, Ramli, Mutalib, Hudiyono, 2012. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.4.5 Analisis Fab’

2 -Nimotuzumab Menggunakan SDS-PAGE Analisis Fab’ 2 -nimotuzumab dengan SDS-PAGE dilakukan dengan menggunakan perangkat Mini-PROTEAN Tetra Cell Electrophoresis Bio Rad. Elektroforesis dilakukan selama 60 menit dengan tegangan 150 volt. Penanda yang digunakan adalah standar protein dengan rentang berat molekul antara 7,1 sampai 209 kDa. Coomasie briliant blue 0,1 sebagai pewarna protein. Pencucian menggunakan stained gel campuran metanol : larutan asam asetat 40 : 7,5 Hermanto, Haryuni, Ramli, Mutalib, Hudiyono, 2012.

3.4.6 Pemekatan Protein dengan Protein Filter

Fab’ 2 -nimotuzumab dipekatkan dengan protein filter MWCO 10.000 yang telah dijenuhkan dengan 10µL BSA 2,5 yang kemudian dikondisikan dengan fosfat K 2 HPO 4 0,1 pH 7,4. Sejumlah Fab’ 2 Nimotuzumab 2 mL dimasukan kedalam protein filter MWCO 10.000 yang kemudian disentrifuse pada 2.500 rpm selama 1 jam sampai volume menjadi 1 mL Haryuni, et al., 2014.

3.5 Penyiapan

177 LuCl 3 177 LuCl 3 disiapkan dengan cara mengiradiasi 0,4 mg 177 Lu 176 LuO 3, pengkayaan 39,60, di RSG-GAS selama 4 hari. Target yang telah diiradiasi kemudiaan dipindahkan kedalam gelas beaker dan kemudian diikuti dengan penambahan 2 mL HCl 6M. Campuran kemudian didiamkan selama 30 menit sebelum penambahan 2 mL H 2 O 2 . Campuran reaksi kemudian dipanaskan dengan pengadukan sampai kering. Garam Lu-177 yang terbentuk kemudian dilarutkan dengan 3 mL HCl 0,025 M Humani, Ramli, Rustendi, Subur, 2010.

3.6 Konjugasi p-SCN-Bz-

DOTA pada Fab’ 2 -Nimotuzumab Kedalam sejumlah 1,27 x 10 -5 mmol Fab’ 2 -nimotuzumab ditambahkan larutan p-SCN-Bz-DOTA 2,545 x 10 -4 mmol, dalam 1 mL dapar fosfat pH 8,5. Campuran kemudian diatur pHnya menjadi 8,5 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta dengan penambahan 0,1 M NaOH. Campuran kemudian diinkubasi pada 4 C seharian. Immunokonjugat p-SCN-Bz-DOTA- Fab’ 2 -nimotuzumab yang terbentuk kemudian dimurnikan dari hasil samping reaksi dengan cara dialisis menggunakan kaset dialisa 20 KD MWCO Vera, Eigner, Henke, Lebeda, Melichar, Beran, 2012.

3.7 Analisis p-SCN-Bz-DOTA-