UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
kDa ;110,49 kDa; dan 72,44 kDa. Hasil analisa berat molekul terangkum pada Tabel 4.3.
Berdasarkan hasil analisa SDS-PAGE pada kedua kondisi yaitu reduksi dan non reduksi menunjukan bahwa nimotuzumab telah
terfragmen sempurna. Kromatogram hasil analisis kemurnian Fab
2
-nimotuzumab yang dimurnikan dengan kolom PD-10 dengan menggunakan KCKT yang
dilengkapi dilengkapi dengan kolom eksklusi ukuran ditampilkan pada Gambar 4.5.
Gambar 4.5.
Kromatogram Fab’
2
-nimotuzumab setelah dimurnikan dengan kolom PD-10.
Kromatogram pada Gambar 4.5 memperlihatkan dua puncak dengan r
t
berurut-turut 6,037 dan 7,423 menit. Puncak pertama dengan r
t
menit dapat dipastikan adalah Fab’
2
-nimotuzumab karena r
t
nya lebih besar dari r
t
-globulin 5,637 menit, BM 158000 Dalton dan lebih kecil dari r
t
ovalbumin 6,497 menit, BM 44000. Puncak kedua dengan r
t
7,423 menit sedikit lebih besar dari r
t
myoglobin 7,563 meit, BM 17000 Dalton sementara itu adalah pengotor. Berdasarkan luas puncak
kromatogram hasil analisa KCKT Fab’
2
-nimotuzumab yang telah dimurnikan dengan kolom PD-10 menunjukan kemurnian sebesar 89,1.
4.5 Konjugasi Fab’
2
-Nimotuzumab dengan p-SCN-Bz-DOTA
Proses konjugasi Fab’
2
-nimotuzumab dengan p-SCN-Bz-DOTA melibatkan pembentukan ikatan tiourea antara gugus
–NH
2
dari Fab’
2
- nimotuzumab dengan gugus tiosianat dari p-SCN-Bz-DOTA Patterson,
Re sp
o n
Ala t
m V
Waktu Retensi menit
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2013. Skema reaksi konjugasi antara Fab’
2
-nimotuzumab dengan p- SCN-Bz-DOTA ditampilkan pada Gambar 4.6.
Konjugat yang terbentuk didialisis menggunakan kaset dialisa dengan MWCO 20 kDa di dalam dapar amonium asetat untuk
memurnikan dari
p-SCN-Bz-DOTA yang
tidak terikat
dan mengkondisikan dalam dapar yang sesuai untuk penandaan.
Gambar 4.6. Skema reaks
i konjugasi antara Fab’
2
-nimotuzumab dengan p-SCN-Bz-DOTA.
Dalam penelitian ini dilakukan dengan perbandingan mol Fab’
2
- nimotuzumab terhadap p-SCN-Bz-DOTA yaitu 1 : 20 dan 1 : 50. Konjugat
p-SCN-Bz-DOT- Fab’
2
-
nimotuzumab yang terbentuk kemudian didialisis menggunakan kaset dialisis dengan MWCO 20 KDalton di dalam dapar
amonium asetat untuk memurnikan dari p-SCN-Bz-DOTA yang tidak terikat dan mengkondisikan dalam dapar yang sesuai untuk penandaan.
Konjugat kemudian dianalisis menggunakan KCKT yang dilengkapi dengan kolom eksklusi ukuran dan detektor UV dan dielusi dengan eluen
PBS 0,01M dan kecepatan alir 0,8 mLmenit. Tabel 4.4 memperlihatkan r
t
p-SCN-Bz-DOTA- Fab’
2
-nimotuzumab dan r
t
Fab’
2
-nimotuzumab serta nimotuzumab sebagai pembanding.
Pada Tabel 4.4 dapat dilihat r
t
puncak p-SCN-Bz-DOTA- Fab’
2
- nimotuzumab
sedikit lebih kecil dibandingkan dengan Fab’
2
- nimotuzumab yang mengindikasikan telah terjadi konjugasi p-SCN-Bz-
DOTA pada Fab’
2
-nimotuzumab sehingga BM menjadi sedikit lebih besar dib
andingkan Fab’
2
-nimotuzumab.
p-SCN-Bz-DOTA Fab’
2
-nimotuzumab
Imunokonjugat p-SCN-Bz-DOTA-
Fab’
2
-nimotuzumab
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Tabel 4.4. Waktu retensi r
t
p-SCN-Bz-DOTA- Fab’
2
-nimotuzumab dan r
t
Fab’
2
-nimotuzumab serta nimotuzumabhasil analisis dengan KCKT. Senyawa
Waktu retensi r
t
menit Nimotuzumab
6,98 Fab2nimotuzumab
7,60 p-SCN-Bz-DOTA-
Fab’
2
-nimotuzumab 7,26
Catatan: Kolom: eksklusi ukuran SEC-18 Agilent, laju alir 0,8 mLmenit.
4.6 Penandaan
