UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Nimotuzumab sebelum dan sesudah dialisis memberikan puncak dengan r
t
berturut-turut pada 5,743 dan 5,737 menit. Puncak nimotuzumab dengan r
t
tersebut jika dibandingkan r
t
standar protein Tabel 4.1 maka BM nimotuzumab diperkirakan sekitar 150.000 Da. Kemurnian
nimotuzumab sebelum dan setelah didialisis berdasarkan persentase luas puncak berurut-turut adalah 96,6 dan 100.
4.2 Fragmentasi Nimotuzumab
Fragmentasi antibodi monoklonal atau imunoglobulin seperti nimotuzumab men
jadi Fab’
2
dapat dilakukan dengan menginkubasi antibodi monoklonal atau imunoglobulin dengan pepsin, dimana pepsin
memotong molekul antibodi monoklonal atau imunoglobulin pada sisi terminal-C hinge region
untuk menghasilkan fragmen Fab’
2
dan degradasi fragmen Fc Hermanson, 1996.
Fragmentasi nimotuzumab untuk mendapatkan fragmen Fab’
2
menggunakaan pepsin dilakukan selama 14 jam pada suhu 37 C Haryuni,
et al., 2014. Proses fragmentasi kemudian dihentikan dengan tris HCl 10 mM pH 8 untuk inaktivasi pepsin. Hasil fragmentasi nimotuzumab dengan
pepsin berupa Fab
2
dan Fc kemudian dicuplik dan dianalisis dengan SDS-PAGE dan KCKT untuk melihat profil nimotuzumab sebelum dan
sesudah fragmentasi.
Fragmen Fab’
2
-niomotuzumab kemudian
dimurnikan dengan kolom PD-10 Sephadex G-25 M.
4.3 Pemurnian Fab’
2
-Nimotuzumab
Pemurnian Fab’
2
-nimotuzumab dari Fc nimotuzumab dilakukan dengan kolom PD-10 yang merupakan kolom kromatografi eksklusi
ukuran. Pada proses pemisahan dengan kolom kromatografi eksklusi ukuran, molekul dengan BM yang besar akan terbawa dengan eluen
melewati sela-sela gel sehingga keluar terlebih dahulu dari kolom, sedangkan molekul dengan BM yang kecil akan terjebak masuk kedalam
pori-pori gel sehingga keluar lebih belakangan Day Underwood, 2001. Berdasarkan prins
ip tersebut Fab’
2
-nimotuzumab akan turun terlebih
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dahulu dibanding Fc nimotuzumab. Gambar 4.4. memperlihatkan cuplikan fraksi-fraksi hasil pemisahan
Fab’
2
-nimotuzumab dari Fc nimotuzumab dengan kolom PD-10 yang telah diberi pewarna protein.
Gambar 4.3. Cuplikan fraksi-fraksi hasil pemisahan
Fab’
2
- nimotuzumab dan Fc nimotuzumab setelah diberi pewarna protein.
Gambar 4.3. diatas memperlihatkan bahwa hanya fraksi 13, 14, dan 15 memberikan memberikan warna biru yang mengindikasikan keberdaan
protein. Fraksi-fraksi ini kemudian dianalisis lebih lanjut dengan KCKT dan SDS-PAGE.
4.4 Analisis K
