UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dahulu dibanding Fc nimotuzumab. Gambar 4.4. memperlihatkan cuplikan fraksi-fraksi hasil pemisahan
Fab’
2
-nimotuzumab dari Fc nimotuzumab dengan kolom PD-10 yang telah diberi pewarna protein.
Gambar 4.3. Cuplikan fraksi-fraksi hasil pemisahan
Fab’
2
- nimotuzumab dan Fc nimotuzumab setelah diberi pewarna protein.
Gambar 4.3. diatas memperlihatkan bahwa hanya fraksi 13, 14, dan 15 memberikan memberikan warna biru yang mengindikasikan keberdaan
protein. Fraksi-fraksi ini kemudian dianalisis lebih lanjut dengan KCKT dan SDS-PAGE.
4.4 Analisis K
emurnian Fab’
2
-Nimotuzumab
SDS-PAGE merupakan metode yang digunakan untuk analisis protein secara kuantitatif dengan memisahkan protein berdasarkan BM
nya. SDS-PAGE sering digunakan untuk menentukan BM protein walaupun tidak akurat untuk beberapa kasus, memonitoring kemurnian
protein, dan mengidentifikasi protein pada sampel yang kompleks Corley, 2005.
Gambar 4.4 memperlihatkan hasil analisis nimotuzumab sebelum dan setelah fragmentasi, standar protein dalam kondisi reduksi 4.4.a dan
non reduksi 4.4.b dengan SDS-PAGE. Penentuan BM nimotuzumab sebelum dan setelah fragmentasi dengan SDS-PAGE dilakukan dengan
membandingkan nilai Rf pita nimotuzumab nilai Rf ini sebanding dengan BM sebelum dan sesudah difragmentasi pada kondisi redu
ksi dengan - merkaptoetanol dan kondisi non reduksi dengan nilai Rf pita-pita standar
protein pada kondisi yang sama. Tabel 4.2 memperlihatkan Rf pita-pita standar dan BM protein - standar.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Gambar 4 .4. Hasil analisis nimotuzumab sebelum dan setelah
fragmentasi, serta fraksi hasil pemurnian dengan SDS-PAGE.
Keterangan : a Reduksi d engan -merkaptoetanol; b Non reduksi; S :
Standar protein; N : Nimotuzumab; F : Nimotuzumab setelah fragmentasi Fraksi No. 13; 14 dan 15; c Perbesaran pita F.
Tabel 4.2. Rf pita-pita standar Vs BM protein
–standar.
No. Protein
BM KDa
Log BM
Rf 1
Myosin 250
2,398 0,194805
2 Β-Galaktosidase 150
2,176 0,305195
3 Phosphorylase b
100 2
0,396104 4
BSA 75
1,875 0,467532
5 Ovalbumin
50 1,699
0,584416 6
Carbonic anhydrase
37 1,568
0,662338 7
Soybean trypsin inhibitor
25 1,398
0,785714 8
Lysozyme 20
1,301 0,844156
9 Aprotinin
15 1,176
0,922078 10
Insulin 10
1 1
Persamaan y = -1.659x + 2.682
c
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Berdasarkan Tabel 4.2 kemudian disiapkan kurva kalibrasi standar potein BM vs Rf yang persamaannya adalah y = -1.659x + 2.682.
Berdasarkan persamaan kurva kalibrasi standar protein, berat molekul dari 2 pita nimotuzumab dan 2 pita dari nimotuzumab setelah fragmentasi
heavy chain Fab, dan campuran dari light chain Fab dan fragmen Fc pada kondisi reduksi berturut-turut adalah 49.08 kDa; 22.19 kDa; 21.65
kDa; dan 22.75 kDa. Hasil tersebut tidak jauh berbeda dengan berat molekul heavy chain Fab, dan campuran dari light chain Fab dan fragmen
Fc dari Fab’
2
-trastuzumab yang telah dilaporkan Hermanto et al., yaitu sebesar 23 kDa dan 22 kDa.
Tabel 4.3. Hasil analisis nimotuzumab sebelum dan setelah fragmentasi
dengan SDS-PAGE
No Protein
Reduksi Non reduksi
Rfcm Berat Molekul
kDa Rfcm
Berat Molekul kDa
1 mAb
0,597 49,08
0,306 149,40
nimotuzumab 0,805
22,19 2
heavy chain Fab
0,799 21,65
- -
3 lightchain
Fab dan fragmen Fc
0,812 22,75
- -
4 Fab
2
- -
0,395 106,34
5 tidak
diketahui -
- 0,5
71,2 Sedangkan pada kondisi non reduksi, berat molekul yang
diperoleh untuk nimotuzumab, dan 2 pita nimotuzumab setelah fragmentasi Fab
2
-nimotuzumab dan protein yang tidak diketahui berturut-turut adalah 149,40 kDa; 106,34 kDa; dan 71,20 kDa.
Dibandingkan dengan literatur, b erat molekul nimotuzumab, Fab’
2
, dan protein yang tidak diketahui pada kondisi non reduksi tidak jauh berbeda
pula dengan yang telah dilaporkan oleh Xiques et.al., yaitu sebesar 153,44
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
kDa ;110,49 kDa; dan 72,44 kDa. Hasil analisa berat molekul terangkum pada Tabel 4.3.
Berdasarkan hasil analisa SDS-PAGE pada kedua kondisi yaitu reduksi dan non reduksi menunjukan bahwa nimotuzumab telah
terfragmen sempurna. Kromatogram hasil analisis kemurnian Fab
2
-nimotuzumab yang dimurnikan dengan kolom PD-10 dengan menggunakan KCKT yang
dilengkapi dilengkapi dengan kolom eksklusi ukuran ditampilkan pada Gambar 4.5.
Gambar 4.5.
Kromatogram Fab’
2
-nimotuzumab setelah dimurnikan dengan kolom PD-10.
Kromatogram pada Gambar 4.5 memperlihatkan dua puncak dengan r
t
berurut-turut 6,037 dan 7,423 menit. Puncak pertama dengan r
t
menit dapat dipastikan adalah Fab’
2
-nimotuzumab karena r
t
nya lebih besar dari r
t
-globulin 5,637 menit, BM 158000 Dalton dan lebih kecil dari r
t
ovalbumin 6,497 menit, BM 44000. Puncak kedua dengan r
t
7,423 menit sedikit lebih besar dari r
t
myoglobin 7,563 meit, BM 17000 Dalton sementara itu adalah pengotor. Berdasarkan luas puncak
kromatogram hasil analisa KCKT Fab’
2
-nimotuzumab yang telah dimurnikan dengan kolom PD-10 menunjukan kemurnian sebesar 89,1.
4.5 Konjugasi Fab’
