UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
0,001 g, spatula, batang pengaduk, pipet tetes, sentrifus Hettich EBA 8 S dose calibrator, rotor, dan sentrifus berpendingin Alegra 64 R.
3.3.2 Bahan
Nimotuzumab Innogene, Kalbe Tech, HCl, NaOH, Lu-177
177
LuCl
3
diperoleh dengan cara mengirradiasi
176
Lu
176
Lu
2
O
3
, pengkayaan 39,60, Isoflex, di RSG-GAS yang kemudian diproses di
laboratorium PTRR, bovine serum albumin BSA, Sigma, resin penukar ion Chelex 100 Bio-Rad, NaCl, asam asetat glasial, natrium asetat,
dipotasium hidrogen fosfat, metanol, potasium dihidrogen fosfat, sodium dodecyl sulfat SDS 10, pewarna protein Bio-Rad, p-SCN-Bz-DOTA,
larutan pewarna Coomasie Blue G-250 Bio-Rad, pepsin serbuk Sigma, Trizma base, air bebas ion hambatan 18,2 MegaOhm, EDTA E.Merck,
N,N,N’N’-tetramethylenthylenediamine TEMED, ammonium peroxide disulfate APS, amonium asetat, protein filter 10.000 MWCO, 5ml, Viva
Science, bromophenol blue , -merkaptoetanol, gliserol, phosphate
buffered salin PBS, Mini-PROTEAN TGX 4-20 Bio-Rad, N’N’-bis-
methylene-acrylamide, celex Bio-Rad, akrilamid, Sephadex G-25, PD-10 dan glisin.
3.4 Fragmentasi Nimotuzumab
3.4.1 Pemurnian Nimotuzumab
Nimotuzumab dimurnikan dari zat tambahan lainnya dengan cara dialisis. Sejumlah nimotuzumab 12,5 mg, 2,5 mL dimasukkan kedalam
kaset dialisis 20 KD MWCO dan kemudian didialisis dalam 0,02 M dapar asetat pH 4,5 pada suhu 4
C selama 72 jam dengan penggantian dapar setiap 24 jam. Nimotuzumab hasil dialisis diukur konsentrasinya
menggunakan spektofotometri UV-Vis dan dianalisis lebih lanjut dengan KCKT Humani, Ramli, Rustendi, Subur, 2010.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.4.2 Fragmentasi Nimotuzumab Menjadi Fab’2
0,625 mg pepsin 3200 Umg ditambahkan ke dalam 2,5 mL larutan nimotuzumab 5mgmL dengan perbandingan 1:4 mgmL.
Campuran diinkubasi dengan Thermomixer pada 300 rpm selama 14 jam pada suhu 37
C. Proses fragmentasi kemudian dihentikan dengan penambahan 3,75 mL tris-HCl pH 8,0. Campuran siap untuk proses
pemurnian Haryuni, et al., 2014.
3.4.3 Pemurnian Fab’
2
-Nimotuzumab
Fragment Fab’
2
-nimotuzumab dipisahkan dari fragmen Fc dengan menggunakan kolom PD-10 di pre-blocked dengan bovine serum
albumin dan pre-equilibrated dengan dapar fosfat 0,01 M pH 7,4. Sejumlah 0,5 µL campuran hasil fragmentasi dimasukan ke bagian atas
kolom yang diikuti dengan proses fraksinasi dengan eluen dapar fosfat 0,01 M pH 7,4. Eluat kemudian ditampung dalam tabung mikro 20
tabung, 0,25 mL tabung. Sejumlah cuplikan 10 µL kemudian diambil dari setiap fraksi dan dimasukkan kedalam 96 micro well. Ke dalam setiap
cuplikan ini kemudian ditambahkan 90 µL pewarna protein BioRad, ¼ vv dalam H
2
O yang dilanjutkan dengan pengamatan perubahan warna absorbansi untuk melihat keberadaan protein hasil fraksinasi. Fraksi-fraksi
yang memberikan warna biru absorbansi kemudian dianalisis lebih lanjut dengan KCKT dan SDS-PAGE non-pereduksi dan pereduksi Haryuni,
et al., 2014.
3.4.4 Analisis Fab’
