Teknik Pemisahan Isolasi Senyawa Flavonoida Dari Albedo Jeruk Bali Merah ( Citrus Maxima Merr. )

2.4.4 Sifat Kelarutan Senyawa Flavonoida

Aglikon flavonoida adalah polifenol dan karena itu mempunyai sifat kimia seperti fenol yaitu bersifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa. Tetapi bila didiamkan dalam larutan basa dan disamping itu terdapat banyak oksigen maka akan banyak yang terurai. Karena mempunyai sejumlah gugus hidroksil yang tak tersulih atau suatu gula, flavonoid merupakan senyawa polar maka pada umumnya flavonoida larut dalam pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, dimetilsulfoksida, dimetilformadida, air dan lain-lain. Adanya gula yang terikat pada flavonoida cenderung menyebabkan flavonoida lebih mudah larut dalam air. Dengan demikian campuran pelarut diatas dengan air merupakan pelarut yang lebih baik untuk glikosida. Sebaliknya, aglikon yang kurang polar seperti isoflavon, flavanon, flavon serta flavanol yang termetoksilasi cenderung lebih mudah larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform Markham, 1988.

2.5 Teknik Pemisahan

Tujuan dari teknik pemisahan adalah untuk memisahkan komponen yang diinginkan dalam keadaan murni, agar tidak bercampur dengan komponen-komponen lainnya Muldja, 1995.

2.5.1 Ekstraksi

Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan substansi atau zat dari campurannya dengan menggunakan pelarut yang sesuai. Ekstraksi dapat digolongkan berdasarkan bentuk campuran yang diekstraksi dan proses pelaksanaanya. a. Bentuk campurannya Berdasarkan bentuk campuran yang diekstraksi, suatu ekstraksi dibedakan menjadi padat – cair dan ekstraksi cair-cair. Universitas Sumatera Utara 1. Ekstraksi Padat-cair ; zat yang diekstraksi terdapat didalam campuran yang berbentuk padatan. Ekstraksi jenis ini banyak dilakukan didalam usaha mengisolasi zat berkhasiat yang terkandung didalam bahan alam seperti steroid, hormon, antibiotika dan lipida pada biji-bijian. 2. Ekstraksi Cair-cair ; zat yang diekstraksi terdapat didalam campuran yang berbentuk cair. Ekstraksi cair-cair sering juga disebut ekstraksi pelarut banyak untuk memisahkan zat seperti iod atau logam-logam tertentu dalam larutan air. b.Proses pelaksanaannya Menurut proses pelaksanaannya ekstraksi dibedakan menjadi ekstraksi berkesinambungan kontinyu dan ekstraksi bertahap. 1. Ekstraksi kontinyu Continues Extraction Pada ekstraksi kontinyu, pelarut yang sama digunakan secara berulang-ulang sampai proses ekstraksi selesai. Tersedia berbagai alat dari jenis ekstraksi seperti ini seperti alat soklet atau Craig Countercurent. 2. Ekstraksi Bertahap Batch Pada ekstraksi bertahap, setiap kali ekstraksi selalu digunakan pelarut yang baru sampai proses ekstraksi selesai. Alat yang biasa digunakan adalah berupa corong pisah Estien, 2005.

2.5.2 Kromatografi

Kromatografi merupakan suatu proses pemisahan yang mana analit-analit dalam sampel terdistribusi antara dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam dapat berupa bahan padat atau porus dalam bentuk molekul kecil, atau dalam bentuk cairan yang dilapiskan pada pendukung padat atau dilapiskan pada dinding kolom. Fase gerak dapat berupa gas atau cairan. Jika gas digunakan sebagai fase gerak, maka prosesnya dikenal sebagai kromatografi gas. Dalam kromatografi cair dan juga kromatografi lapis tipis, fase gerak yang digunakan selalu cair Rohman, 2009. Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan cara melihat langsung beberapa sifat fisika umum dari molekul. Sifat utama yang terlibat ialah: Universitas Sumatera Utara 1 kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan, 2 kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus dan 3 kecenderungan molekul untuk menguap atau berubah kekeadaan uap Gritter, 1991.

2.5.2.1 Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis adalah kromatografi cair yang paling sederhana, yang mana fase geraknya berupa zat cair dan fase padatnya berupa padatan yang disokong pada sebuah penyangga Gritter, 1991. KLT merupakan salah satu metode yang paling banyak digunakan dan paling mudah untuk memurnikan sejumlah kecil komponen. Metode ini menggunakan lempeng kaca atau aluminium yang telah dilapisi dengan penyerap misalnya silika gel dengan ketebalan tertentu tergantung pada jumlah bahan yang akan dimuat kedalam lempeng. Pelapisan ke dalam lempeng analis biasanya memiliki ketebalan 0,2 mm. Campuran senyawa diisikan 1-2 cm dari tepi dasar lempeng berupa bercak ataupun pita memanjang. Lempeng kemudian dimasukkan ke dalam bejana kromatografi berisi pelarut yang telah ditentukan sebelumnya yang akan meresap naik di dalam lempeng dan memisahkan campuran senyawa berdasarkan polaritas komponennya Heinrich, 2005. Kelebihan KLT ialah keserbagunaan, kecepatan dan kepekaannya. Keserbagunaannya dapat menggunakan sejumlah penyerap yang berbeda-beda yang disapitkan pada pelat kaca atau penyangga lain seperti, silika gel, aluminium oksida, kalium hidroksida, magnesium pospat dan lain sebagainya. Kecepatan KLT yang lebih besar disebabkan oleh sifat penyerap yang lebih padat bila disaputkan pada plat dan merupakan keuntungan apabila kita menelaah senyawa labil. Kepekaan dari KLT adalah dapat memisahkan bahan yang jumlahnya lebih sedikit dari ukuran µg Harborne, 1973. Metode ini memiliki sejumlah keuntungan untuk analisis dan isolasi bahan alam yang aktif secara biologis : • Biayanya murah dibandingkan metode instrumental dan hanya butuh sedikit pelatihan atau pengetahuan tentang kromatografi. • Proses peningkatan skala dari cara analitik ke preparatif mudah dilakukan Universitas Sumatera Utara dengan isolasi cepat bahan alam dalam jumlah milligram hingga gram. • Fleksibilitas pilihan fase gerak dan fase diam. • Pemisahan mudah dioptimalisasi dengan ‘membidik’ satu komponen dan metode dapat segera dikembangkan. • Secara praktis semua pemisahan dapat dicapai dengan fase gerak dan fase diam yang tepat. • Sejumlah besar sampel dapat dianalisis atau dipisahkan secara simultan Heinrich, 2005. Untuk mengidentifikasi suatu senyawa, maka harga Rf senyawa tersebut dapat dibandingkan dengan harga Rf senyawa pembanding, yang mana harga Rf diidentifikasikan sebgai perbandingan antara jarak perambatan suatu zat dengan jarak perambatan pelarut yang dihitung dari titik penotolan pelarut zat Sastrohamidjojo,1985. Laju pergerakan linarut Rf = Laju pergerakan pelarut Gritter, 1991 Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam KLT yang juga mempengaruhi harga Rf Sastrohamijdojo, 1985 : 1. Struktur kimia dari senyawa yang dipisahkan 2. Sifat dari penyerap dan derajat aktivasi 3. Tebal kerataan dan lapisan penyerap 4. Pelarut dan derajat kemurnian fase gerak 5. Derajat kejenuhan dari uap 6. Jumlah cuplikan yang digunakan 7. Suhu 8. Kesetimbangan

2.5.2.2 Kromatografi Kolom

Dengan menggunakan cara ini skala isolasi flavonoid dapat ditingkatkan hampir ke skala industri. Pada dasarnya, cara ini meliputi penempatan campuran flavonoid Universitas Sumatera Utara berupa larutan diatas kolom yang berisi serbuk penyerap seperti selulosa, silika atau poliamida, dilanjutkan dengan elusi beruntun setiap komponen memakai pelarut yang cocok Markham, 1988. Kromatografi cair yang dilakukan didalam kolom besar merupakan metode kromatografi terbaik untuk pemisahan campuran dalam jumlah besar. Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom penyerap yang berada dalam tabung kaca, tabung logam atau bahkan tabung plastik. Pelarut fase gerak dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau didorong dengan tekanan. Pita senyawa linarut bergerak melalui kolom dengan laju yang berbeda, memisah, dan dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar dari atas kolom. Fase diam yang digunakan adalah silika gel. Penyerap dapat dikemas kedalam tabung, baik dengan cara basah maupun dengan cara kering. Pada umumnya, cara basah lebih mudah dan lebih sering dipakai untuk silika gel, sedangkan cara kering lebih baik untuk alumina. Pada cara basah, selapisan kapas dimasukkan ke dalam kolom dan tabung diisi sepertiganya dengan pelarut. Pelarut yang dipakai dalam proses pengemasan mungkin sama dengan pelarut yang akan dipakai untuk kromatografi atau mungkin pelarut yang kepolarannya lebih rendah. Pelarut itu tidak boleh polar. Penyerap lumpuran dengan bagian lain dari pelarut dan lumpuran ini dituangkan ke dalam pelarut dalam tabung. Selama proses pengendapan, tabung dapat diketuk-ketuk pada semua sisi secara perlahan-lahan agar diperoleh lapisan yang seragam. Lumpuran dapat dimasukkan bagian demi bagian atau sekaligus. Keran dapat dibuka dan ditutup selama penambahan asal permukaan pelarut tetap diatas permukaan penyerap Gritter, 1991.

2.5.2.3 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Pada KLT preparatif, cuplikan yang akan dipisahkan ditotolkan berupa garis pada salah satu sisi pelat lapisan besar Gritter, 1991, ketebalan yang paling sering dipakai ialah 0,5-2 mm, ukuran platnya biasanya 20x20 cm. Universitas Sumatera Utara Penotolan Cuplikan Cuplikan dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum ditotolkan pada plat KLTP. Pelarut yang yang baik ialah pelarut atsiri, karena jika pelarut kurang atsiri terjadi pelebaran pita. Konsentrasi cuplikan harus sekitar 5-10. Cuplikan ditotolkan berupa pita yang harus sesempit mungkin karena pemisahan bergantung pada lebar pita. Penotolan dapat dilakukan dengan tangan pipet tetapi lebih baik dengan penotol otomatis. Untuk pita yang terlalu lebar, dapat dilakukan pemekatan dengan cara pengembangan memakai pelarut polar sampai kira-kira 2 cm diatas tempat penotolan. Kemudian pelat dikeringkan dan dielusi dengan pelarut yang diinginkan Marston, 1986 dan dapat dikembangkan secara tegak lurus pada garis cuplikan sehingga campuran akan terpisah menjadi beberapa pita. Pita ditampakkan dengan cara yang tidak merusak jika senyawa itu tanpa warna, dan penyerap yang mengandung pita dikerok dari pelat kaca. Kemudian cuplikan dielusi dari penyerap dengan pelarut polar Gritter, 1991. Penyerap yang paling umum ialah silika gel Marston, 1986. Cara ini berguna untuk memisahkan campuran reaksi sehingga diperoleh senyawa murni untuk telaah pendahuluan, untuk menyiapkan cuplikan analisis, untuk meneliti bahan alam yang lazimnya berjumlah kecil dan campurannya rumit dan untuk memperoleh cuplikan yang murni untuk mengkalibrasi KLT kuantitatif Gritter, 1991.

2.6 Teknik Spektroskopi