BAB 3
METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Alat – Alat
1. Gelas ukur 50 ml100 ml
Pyrex 2. Gelas Beaker
250 ml1000ml Pyrex
3. Gelas Erlenmeyer 250 ml
Pyrex 4. Corong kaca
5. Corong pisah 500 ml
Pyrex 6. Kolom kromatografi
Pyrex 7. Tabung reaksi
Pyrex 8. Bejana maserasi
10 L SchottDuran
9. Rotari evaporator Buchi R-114
10. Kertas aluminium 7,6 m x 300 mm
Total Wrap 11. Statif dan klem
12. Lampu UV 254 nm356 nm
UVGL 58 13. Spatula
14. Neraca analitis Mettler AE 200
15. Pipet tetes 16. Penangas air
Buchi B-480 17. Botol vial
18. Vakum Buchi B-169
19. Bejana Kromatografi Lapis Tipis 20. Spektrofotometer FT-IR
Shimadzu 21. Spektrofotometer ‘H-NMR JeolDelta2NMR-500MHz
22. Spektrofotometer UV-Visible 23. Kertas saring
Universitas Sumatera Utara
3.2 Bahan – Bahan
1. Albedo jeruk bali merah Citrus maxima.Merr
2. Metanol Teknis
3. n-Heksana Teknis
4. Etil asetat Teknis
5. Aquadest 6. Aseton
Merck 7. Kloroform
8. Silika gel 40 70-230 mesh ASTM E.Merck. KGaA
9. FeCl
3
5 10. NaOH 10
11. Mg-HCl 12. H
2
SO
4p
13. Pelat KLT silika gel 60 F
254
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1. Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah albedo jeruk bali merah yang diperoleh dari daerah Rambung Baru, Sembahe, Kecamatan Sibolangit, Kabupaten Deliserdang , Sumatera
Utara. Albedo jeruk bali merah dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk albedo jeruk bali merah sebanyak 1030 gram.
3.3.2. Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Albedo Jeruk Bali Merah
Serbuk albedo jeruk bali merah diidentifikasi dengan menggunakan cara : 1. Skrining fitokimia
2. Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Universitas Sumatera Utara
3.3.2.1 Skrining Fitokimia
Untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida pada albedo jeruk bali merah, maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif sebagai berikut :
- Dimasukkan ± 10 gram serbuk albedo jeruk bali merah C Maxima Merr.
yang telah dikeringkan dan dipotong-potong kecil ke dalam Erlenmeyer -
Ditambahkan metanol ± 100 ml -
Didiamkan -
Disaring -
Dibagi ekstrak metanol kedalam 4 tabung reaksi -
Ditambahkan masing-masing pereaksi a. Tabung I : dengan FeCl
3
5 menghasilkan larutan berwarna hitam. b. Tabung II : dengan H
2
SO
49p
menghasilkan larutan berwarna orange kekuningan.
c. Tabung III : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan bewarna merah muda. d. Tabung IV : dengan NaOH 10 menghasilkan larutan bewarna biru violet.
3.3.2.2 Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis Kromatografi lapis tipis dilakukan terhadap ekstrak kloroform dengan menggunakan fasa diam silika gel 60F
254
Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai untuk kromatografi kolom. Fasa gerak yang digunakan
90:10 ; 80:20 ; 70:30 ; 60:40 vv. Dimasukkan 10 ml larutan fase gerak n-heksana : etil asetat 90:10 vv ke dalam
bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat kloroform pada plat KLT yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat kedalam bejana yang telah berisi
pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan dan difiksasi dengan perekasi FeCl
3
5. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan
yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 80:20; 70:30; 60:40 vv. Dari hasil analisis KLT menunjukkan bahwa
di dalam albedo jeruk bali merah terkandung senyawa flavonoida. Hasil pemisahan
Universitas Sumatera Utara
yang baik diberikan pada fase gerak n-heksana : etil asetat 80:20 vv LAMPIRAN C.
3.3.3. Prosedur Memperoleh Ekstrak Pekat Lapisan Metanol dari Albedo Jeruk Bali Merah
Serbuk albedo jeruk bali merah ditimbang sebanyak 1030 g, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak 9 L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama ±
72 jam. Maserat ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan hingga semua pelarut
metanol menguap.
3.3.4. Pemisahan Tanin
Ekstrak pekat metanol dari serbuk albedo jeruk bali merah di diuapkan sampai pelarut metanol menguap habis, kemudian dilarutkan dengan pelarut etil asetat untuk
memisahkan tanin dengan flavonoida, yang mana tanin tidak larut dalam pelarut etil asetat. Kemudian disaring dan filtrat yang didapatkan dirotarievaporator dan diuapkan
sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol bebas tanin.
3.3.5. Hidrolisa
Ekstrak pekat metanol bebas tanin dihidrolisa yang bertujuan untuk memutuskan ikatan gula pada senyawa flavonoida dengan menggunakan HCl 6. Ekstrak pekat
metanol bebas tanin dilarutkan dengan HCL 6 dengan perbandingan sampel dan HCl 2:5, dipanaskan diatas penangas air selama ± 30-40 menit, kemudian disaring dan
didapatkan filtrat yang sudah bebas gula.
Universitas Sumatera Utara
3.3.6. Ekstraksi Partisi dengan Kloroform
Filtrat yang sudah bebas gula diekstraksi partisi dengan kloroform secara berulang- ulang, sehingga didapatkan ekstrak kloroform dan dipekatkan kembali dan dipanaskan
sampai kering sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform sebanyak 1,575 gr.
3.3.7. Pemisahan Komponen dengan Kromatografi Kolom
Pemisahan komponen secara kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat kloroform yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40 70-230 mesh ASTM
dan fasa gerak yaitu n-heksana 100, campuran pelarut n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 90:10 vv, 80:20 vv, 70:30 vv dan 60:40 vv. Dirangkai alat kolom
kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40 70-230 mesh ASTM dengan menggunakan n-heksan, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan dalam kolom
kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksan 100 hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 1,575 g ekstrak metanol albedo jeruk bali merah
kedalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksan: etil asetat 90:10 vv secara perlahan-lahan dan diatur sehingga
aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak n-heksana : etil
asetat dengan perbandingan 80:20vv,70:30vv dan 60:40 vv. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 8 ml, lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga
Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl
3
5. Kemudian diuapkan sampai terbentuk Kristal. Kristal yang diperoleh dari isolasi dengan kromatografi kolom dilarutkan
kembali dengan Me-OH lalu dianalisis KLT untuk mengetahui apakah senyawa yang diperoleh sudah murni atau belum sekaligus mencari fasa gerak yang sesuai untuk
preparatif KLT.
Kristal yang telah dilarutkan tadi ditotolkan secara perlahan-lahan dan sama rata disepanjang tepi bawah plat KLT yang berukuran 20x20 yang telah dibuat garis batas
bawah dan batas atas sepanjang 2 cm, plat yang digunakan harus sudah diaktifkan terlebih dahulu. Plat dimasukkan kedalam bejana yang berisi pelarut yang dijenuhkan,
Universitas Sumatera Utara
kemudian ditutup. Setelah dielusi plat dikeluarkan dari bejana, dikeringkan dan hasilnya diperiksa dibawah sinar UV. Tiap zona diberi tanda dan dikeruk lalu dielusi
dengan perbandingan pelarut metanol dan etil asetat 1:1. Hasil elusi diuapkan sehingga diperoleh kristal.
3.3.8 Pemurnian Hasil Isolasi
3.3.8.1 Pemurnian Hasil Isolasi Dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Senyawa hasil isolasi di murnikan kembali dengan cara kromatografi lapis tipis preparatif ketika masih terdapat dua noda atau lebih, kristal hasil isolasi dari
kromatografi kolom dilarutkan kembali dengan etil asetat kemudian ditotolkan pada plat KLT yang berukuran 20x20 yang telah diberi batas atas dan batas bawah,
kemudian noda dikeringkan dan ditotolkan lagi berulang dengan cara penotolan horizontal lalu dikeringkan kembali sapai benar-benar terserap silika pada plat KLT
yang digunakan. Dimasukkan plat KLT pada chamber yang berisi perbandinagn pelarut yang sesuai untuk menaikkan noda yaitu digunakan benzena : aseton 8:2 vv
pada saat mencapai batas atas plat KLT diangkat dan didiamkan kemudian dimasukkan kembali sampai 3 kali pemasukan plat kedalam chamber supaya noda-
nodanya benar-benar terpisah dengan baik, kemudian diangkat dan dikeringkan, plat disinari dengan lampu UV kemudian ditandai noda yang terpisah kemudian dikeruk
dengan menggunakan alat pengeruk dan dimasukkan kedalam kolom kecil yang dibawahnya telah dibuat kapas sebagai penyaringnya kemudian diekstraksi pada
kolom kecil tersebut dengan menggunakan pelarut metanol:etil asetat 1:1 dibiarkan sampai filtratnya habis turun, filtrat yang ditampung dikristalisasi dengan penguapan
kembali pelarut sampai terbentuk kristal, kemudian di KLT kembali untuk melihat apakah kristal sudah murni dengan 1 noda dan positif dengan test FeCl
3
dan terlihat pada lampu UV.
Universitas Sumatera Utara
3.3.8.2 Rekristalisasi
Senyawa yang diperoleh dari isolasi dilarutkan kembali dengan etil asetat diaduk sehingga semua padatan larut sempurna. Kemudian ditambahkan n-heksan, yang mana
tidak dapat melarutkan senyawa yang diisolasi, secara perlahan-lahan sehingga terjadi pengendapan senyawa didasar wadah. Kemudian didekantasi larutan bagian atas
wadah, lalu diuapkan sisa pelarut dari yang masih tertinggal sehingga diperoleh padatan yang benar-benar bebas dari pelarut.
3.3.9 Uji Kemurnian Hasil Isolasi
3.3.9.1 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT
Uji kemurnian kristal yang dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
dengan fasa gerak n-heksana : etil asetat 80:20 vv. Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak kedalam bejana kromatografi, lalu
dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan dengan etil asetat pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut kedalam bejana kromatografi yang telah jenuh.
Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl
3
5 dalam metanol menghasilkan bercak bewarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa
flavonoida.
3.3.9.2 Uji Kemurnian Hasil Isolasi Dengan Penentuan Titik Lebur
Kristal hasil isolasi yang telah murni dimasukkan ke dalam melting point apparatus lalu diamati pada suhu berapa kristal melebur.
Universitas Sumatera Utara
3.3.10. Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.10.1. Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisis dengan alat Spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Laboratorium Pusat Pennelitian Kimia – LIPI, kawasan PUSPITEK Serpong, Tangerang dengan
menggunakan metanol sebagai pelarut.
3.3.10.2. Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah FT-IR
Analisis dengan alat Spektrofotometer FT-IR ddiperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, Kawasan PUSPITEK Serpong, Tangerang.
3.3.10.3. Identifikasi dengan Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H-NMR
Analisis dengan alat Spektrometer
1
H-NMR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, Kawasan PUSPITEK Serpong, Tangerang dengan
menggunakan aseton sebagai pelarut.
Universitas Sumatera Utara
3.4. Bagan Skrining Fitokimia