Penotolan Cuplikan Cuplikan dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum ditotolkan pada plat KLTP. Pelarut
yang yang baik ialah pelarut atsiri, karena jika pelarut kurang atsiri terjadi pelebaran pita. Konsentrasi cuplikan harus sekitar 5-10. Cuplikan ditotolkan berupa pita yang
harus sesempit mungkin karena pemisahan bergantung pada lebar pita. Penotolan dapat dilakukan dengan tangan pipet tetapi lebih baik dengan penotol otomatis.
Untuk pita yang terlalu lebar, dapat dilakukan pemekatan dengan cara pengembangan memakai pelarut polar sampai kira-kira 2 cm diatas tempat penotolan. Kemudian pelat
dikeringkan dan dielusi dengan pelarut yang diinginkan Marston, 1986 dan dapat dikembangkan secara tegak lurus pada garis cuplikan sehingga campuran akan
terpisah menjadi beberapa pita. Pita ditampakkan dengan cara yang tidak merusak jika senyawa itu tanpa warna, dan penyerap yang mengandung pita dikerok dari pelat kaca.
Kemudian cuplikan dielusi dari penyerap dengan pelarut polar Gritter, 1991. Penyerap yang paling umum ialah silika gel Marston, 1986.
Cara ini berguna untuk memisahkan campuran reaksi sehingga diperoleh senyawa murni untuk telaah pendahuluan, untuk menyiapkan cuplikan analisis, untuk meneliti
bahan alam yang lazimnya berjumlah kecil dan campurannya rumit dan untuk memperoleh cuplikan yang murni untuk mengkalibrasi KLT kuantitatif
Gritter, 1991.
2.6 Teknik Spektroskopi
Penentuan struktur kimia senyawa organik secara spektroskopi dapat dilakukan jika senyawa organik tersebut diperoleh dalam keadaan murni, adanya pengotor akan
dihasilkan spektra yang lebih kompleks sehingga akan menyulitkan dalam interpretasi spektra. Selanjutnya dari spektra massa dan NMR akan diperoleh rumus formula dan
derajat ketidakjenuhan atau juga dikenal dengan ekuivalensi ikatan rangkap. Spektra NMR, infra merah dan UV-Vis akan memberikan informasi adanya gugus fungsional,
selain itu dari spektra NMR akan memberikan adanya bagian-bagian struktur pembentuk senyawa tersebut.
Universitas Sumatera Utara
2.6.1 Spektrofotometer Ultraviolet- Visibel UV-Vis
Asas Radiasi ultraviolet dan sinar tampak diabsorpsi oleh molekul organik aromatik,
molekul yang mengandung elektron- π terkoyugasi dan atom yang mengadung
elektron-n, menyebabkan transisi elektron di orbit terluarnya dari tingkat enersi elektron dasar ke tingkat enersi elektron tereksitasi lebih tinggi Satiadarma, 2004.
Penyerapan sinar ultraviolet dan tampak oleh suatu molekul organik akan menghasilkan transisi diantara tingkat energi elektronik pada molekul tersebut , dan
karenanya sering dinamakan Spektrometri elektronik. Transisi tersebut pada umumnya antara orbital ikatan atau orbital pasangaan elektron bebas ke orbital anti ikatan.
Supaya elektron dalam ikatan sigma tereksitasi maka diperlukan energi paling tinggi dan akan memberikan serapan pada panjang gelombang 120-200 nm. Panjang
gelombang di atas 200 nm merupakan daerah eksitasi elektron dari o rbital π dan
orbital d ,terutama untuk si stem ikatan π terkonyugasi, pengukurannya relatif mudah
dan spektrumnya memberikan banyak keterangan, maka spektrometri ultraviolet tampak biasa dilakukan pada α di atas 200 nm. Kegunaan spektrofotometer ini terletak
pada kemampuannya mengukur jumlah ikatan rangkap atau konjugasi aromatik didalam suatu molekul Unang, 2010.
Cara Spektroskopi Ultraviolet- Visibel UV-Vis merupakan cara tunggal yang paling berguna untuk menganalisis struktur flavonoid, untuk membantu mengidentifikasi
jenis flavonoid dan menentukan pola oksigenasinya. Spektrum flavonoid biasanya ditentukan dalam larutan dengan pelarut metanol atau etanol. Spektrum khas terdiri
atas dua maksima pada rentang 240-285 nm pita II dan 300-550 nm pita I. Kedudukan yang tepat dan kekuatan nisbi maksima tersebut memberikan informasi
yang berharga mengenai sifat dan pola oksigenasinya. Ciri khas spektrum adalah kekuatan nisbi yang rendah pada pita I dalam dihidroflavon, dihidroflavonol dan
isoflavon serta kedudukan pita I pada spektrum khalkon, auron dan antosianin yang terdapat pada panjang gelombang yang tinggi. Petunjuk mengenai rentang maksima
utama yang diperkirakan untuk setiap jenis flavonoida adalah sebagai berikut :
Universitas Sumatera Utara
Tabel 2.2 Rentang serapan spektrum UV-tampak flavonoida
λ maksimum
utama nm λ maksimum tambahan
nm dengan intensitas nisbi
Jenis flavonoida
475-560 390-430
365-390 350-390
250-270 330-350
300-350 275-295
± 225 310-330
± 275 55 240-270 32
240-260 30 ± 300 40
± 300 40 tidak ada
tidak ada 310-330 30
310-330 30 310-330 25
Antosianin Auron
Kalkol Flavonol
Flavonol Flavon dan biflavonil
Flavon dan biflavonil Flavanon dan flavononol
Flavonon dan flavononon Isoflavon
Markham,1988
2.6.2 Spektrofotometer Infra Merah FT-IR
Asas Apabila radiasi inframerah tengah mengenai molekul organik, frekuensi tertentu yang
enersinya sesuai dengan frekuensi energi vibrasi dan rotasi atomgugus atom dalam molekul, akan diabsorpsi dan digunakan untuk eksitasi pada tingkat enersi vibrasi dan
rotasi khas dari molekul. Spektrum absorpsi radiasi yang terbentuk, khas untuk molekul senyawa organik yang bersangkutan Satiadarma, 2004.
Spektrum Infra Merah hasil dari penyerapan energi yang mempengaruhi mode getaran atom yang terikat satu sama lain. Untuk molekul organik yang khas, harus ada banyak
pita penyerapan, masing-masing dihasilkan oleh salah satu dari banyak kelompok yang berbeda dari atom. karena hampir semua senyawa organik mengandung obligasi
C-C dan C-H , banyak pita-pita dalam spektrum IR akan umum untuk sebagian besar
Universitas Sumatera Utara
substansi dan karena itu tidak informatif. Spektroskopi IR sangat berguna untuk mengetahui kelompok gugus fungsional yang terdapat dalam molekul
Thomas, 1998.
Pancaran infra-merah di julat antara 10.000-10 cm 1-100µm, diserap oleh sebuah molekul organik dan diubah menjadi energi getaran molekul. Penyerapan ini juga
tercatu , namun spektrum getaran tampak bukan sebagai garis melainkan berupa pita- pita. Hal itu disebabkan perubahan energi getaran tunggal selalu disertai sejumlah
energi putaran. Terdapat dua macam getaran molekul, yaitu getaran ulur dan getaran tekuk. Getaran ulur adalah suatu getaran berirama di sepanjang sumbu ikatan sehingga
jarak antar atom bertambah atau berkurang. Getaran tekuk dapat terjadi karena perubahan sudut-sudut ikatan antara ikatan-ikatan pada sebuah atom atau karena
gerakan sebuah gugusan atom terhadap sisa molekul tanpa gerakan nisbi atom-atom didalam gugusan Silverstein, 1986.
2.6.3 Spektrofotometri Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H-NMR
Spektroskopi RMI proton pada hakikatnya merupakan sarana untuk menentukan struktur senyawa organik dengan mengukur momen magnet atom hidrogennya. Pada
kebanyakan senyawa, atom hidrogen terikat pada gugus yang berlainan dan spektrum RMI proton merupakan rekaman sejumlah atom hidrogen yang berada dalam keadaan
lingkungan yang berlainan tersebut. Tetapi, tidak dapat memberikan keterangan langsung mengenai sifat kerangka karbon molekul tersebut. Pelarut untuk pengukuran
RMI harus lembam dan tanpa proton.
Dalam praktek, larutan cuplikan dalam pelarut lembam ditempatkan diantara kutub magnet yang kuat, dan proton mengalami geser kimia yang berlainan sesuai dengan
lingkungan molekulnya didalam molekul, biasanya menggunakan tetrametilsilan TMS, yaitu senyawa lembam yang dapat ditambahkan kedalam larutan cuplikan
tanpa ada kemungkinan terjadi reaksi kimia Harborne, 1973.
Universitas Sumatera Utara
Spektroskopi NMR didasarkan pada penerapan gelombang radio oleh inti tertentu dalam molekul organik, bila molekul ini berada dalam magnet yang sangat kuat dan
homogen . Dari spektra resonansi magnet inti proton akan diperoleh informasi tentang jenis hidrogen, jumlah hidrogen dan lingkungan hidrogen dalam suatu senyawa
Unang, 2010
Terperisai dan tak terperisai merupakan istilah relatif. Untuk memperoleh pengukuran yang kuantitatif diperlukan suatu titik rujukan. Senyawa yang dipilih untuk rujukan
adalah Tetrametilsilana CH
3 4
Si, yang proton-protonnya menyerap pada ujung kanan spektrum NMR Fessenden, 1982.
Pada beberapa apektrum NMR akan terlihat sinyal TMS pada angka nol sehingga sinyal ini tidak perlu dianalisa. TMS dipilih sebagai standart karena :
1. TMS mempunyai 12 atom hidrogen yang keseluruhannya mempunyai lingkungan kimia yang sama, sehingga menghasilkan singlet yang kuat karena
banyak mengandung atom hidrogen 2. Elektron-elektron pada ikatan C-H dalam senyawa ini berada dekat dengan
hidrogen jika dibanding dengan senyawa lain. Ini berarti inti hidrogen sangat terlindungi dari medan magnet eksternal sehingga dibutuhkan medan magnet
yang besar untuk membawa atom hidrogen ke kondisi resonansi Dachriyanus, 2004.
Universitas Sumatera Utara
BAB 3
METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Alat – Alat
